UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA ESCUELA DE POST GRADO MAESTRÍA EN QUÍMICA DEL MEDIO AMBIENTE “CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y LIBERACION DE ALUMINIO, In vitro - In vivo, DE LA ARCILLA (CHACO) – 2015” TESIS PRESENTADA POR LA BACHILLER: Celia Choquenaira Quispe PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN QUÍMICA DEL MEDIO AMBIENTE ASESOR: Dr. Gonzalo Dávila Del Carpio AREQUIPA – PERÚ 2016 AGRADECIMIENTOS Dios, tú eres el principal actor de esta obra tan maravillosa, todo te lo debo a ti. El presente trabajo de tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente, participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, brindándome su apoyo incondicional, acompañándome en los momentos de crisis y en los momentos de felicidad. A mis padres y mis hermanos porque a pesar de la carga laboral, estudios y la distancia siempre estuvieron atentos al desarrollo del presente trabajo. Mi especial agradecimiento a la persona que en los momentos difíciles supo apoyarme y brindarme su ayuda incondicional, porque a pesar de los inconvenientes jamás dejo que decline y en los momentos de felicidad hizo hasta lo imposible para que siga sonriendo, gracias por los detalles y el apoyo durante este periodo, te amo Tom (Ever). Quiero agradecer al Doctor José A. Villanueva Salas, por todo el tiempo compartido y porque siempre estuvo en el momento preciso en el desarrollo de las investigaciones, gracias por la paciencia, las enseñanzas y la inspiración hacia el desarrollo personal y profesional. Agradezco al Doctor Gonzalo Dávila del Carpio, por haber sido el promotor principal para la ejecución de la maestría, por el asesoramiento de la tesis y el tiempo brindado. Finalmente mi especial agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación tecnológica (CONCYTEC) por financiar la ejecución y desarrollo de la Maestría en Química del Medio Ambiente en convenio con la Universidad Católica de Santa María. Dios gracias por la oportunidad brindada. INDICE Pág. CONTENIDO RESUMEN ............................................................................................................... 1 ABSTRACT ............................................................................................................. 3 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 6 HIPÓTESIS ............................................................................................................. 7 PLANTEAMIENTO TEÓRICO ........................................................................... 8 1. Problema de investigación ............................................................................... 8 1.1. Enunciado del problema ......................................................................... 8 1.2. Descripción del problema ....................................................................... 8 1.3. Justificación del problema ....................................................................... 9 CAPÍTULO II 1. MARCO CONCEPTUAL ............................................................................ 10 1.1. Geomedicina ........................................................................................... 10 1.2. Arcilla ..................................................................................................... 11 1.3. Ensayos in vitro ...................................................................................... 14 1.4. Ensayos in vivo ....................................................................................... 15 1.5. ICP-OES ................................................................................................. 15 2. ANÁLISIS DE ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS .............................. 16 CAPÍTULO III 1. PLANTEAMIENTO OPERACIONAL .......................................................... 19 1.1. Instrumentos, materiales y reactivos ...................................................... 19 1.2. Validación del método en el ICP-OES .................................................. 20 1.3. Metodología ........................................................................................... 22 Obtención y caracterización de la arcilla ............................................... 22 Ensayos in vitro – perfil de disolución ................................................... 23 Ensayos in vivo ....................................................................................... 26 Obtención y tratamiento de muestras biológicas .................................... 29 Cálculos y análisis estadísticos .............................................................. 30 2. CAMPO DE VERIFICACIÓN ........................................................................ 30 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................................................ 32 Resultados – ensayos in vitro ............................................................................... 40 Resultados – ensayos in vivo ................................................................................ 61 CONCLUSIONES ................................................................................................... 83 SUGERENCIAS ...................................................................................................... 84 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 85 ANEXOS .................................................................................................................. 93 1 RESUMEN Geofagia, la ingestión intencional y repetida de arcillas, suelos, u otros materiales geológicos se ha practicado durante siglos en todo el mundo con fines terapéuticos y alimenticios. En nuestro país la arcilla “chaco” es utilizada desde tiempos precolombinos en forma de suspensión para tratar síntomas de enfermedades acido-pépticas. En tal sentido, en el presente trabajo de investigación, se realizó un análisis fisicoquímico de la arcilla “chaco” para posteriormente determinar la liberación de aluminio de la arcilla en diferentes medios de disolución (ensayo in vitro) y finalmente evaluar la disponibilidad de este elemento en animales de experimentación (ensayo in vivo). La cantidad de aluminio liberado en los ensayos in vitro e in vivo fue determinada en el espectrómetro de emisión óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP-OES). Los resultados in vitro evidencian una relación directamente proporcional entre la cantidad de arcilla y la liberación de aluminio, la cantidad de aluminio in vitro depende del tipo de medio de disolución observándose una mayor liberación de aluminio (3.057 ± 0.019 mg/L) en jugo intestinal simulado y una menor liberación (1.533 ± 0.019) a pH 1.2. Los resultados in vivo determinan que la administración de Dosis 1 (Do1) (50mg/kg) y Dosis 2 (Do2) (500 mg/kg), producen un incremento exponencial de la concentración de aluminio plasmático en las primeras 6 horas alcanzando 1 concentraciones máximas de 18.644 ± 0.976 y 21.406 ± 0.968 mg/L respectivamente, a partir de las 8 horas, se evidencia el decaimiento de ambas líneas de tendencia lo cual indica que la concentración de aluminio en sangre disminuye en función del tiempo. Además, se observa que a mayor dosis de arcilla administrada, mayor es la cantidad de aluminio liberado y por ende mayor es la cantidad detectada en sangre. Así mismo, después de 24 horas de administrada la arcilla, las cantidades de aluminio disminuyen a valores cercanos a los basales En relación a las muestras de orina, la concentración de aluminio a las 24 horas, cuando se ensaya con la Do1, es de 8.351 ± 0.298 mg/L, el cual comparada con la máxima concentración de aluminio en sangre de este mismo grupos, representa el 44.79%, este valor representa el porcentaje de aluminio excretado vía urinaria en las primeras 24 horas. En relación al grupo Do2, la máxima concentración de aluminio excretado vía renal es de 11.257 ± 0.358 mg/L que representa un porcentaje de eliminación del 52.59% en las primeras 24 horas. El ingesta de arcilla “chaco” y su exposición a cambios de pH dentro del tracto gastrointestinal produce la liberación y absorción del aluminio, pudiendo ocasionar efectos negativos en la salud. 2 ABSTRACT Geophagia, intentional and repeated clays, soil, or other geological materials ingestion has been practiced for centuries worldwide for therapeutic and nutritional purposes. In our country the clay "chaco" is used since pre-Columbian times as a suspension to treat symptoms of acid-peptic diseases. In this sense, the present research, a physicochemical analysis of clay "chaco" to subsequently determine the release of aluminum from clay in different dissolution media (in vitro assay) was performed and finally evaluate the availability of this element in experimental animals (in vivo assay). The amount of aluminum released in vitro and in vivo assays was determined in the optical emission spectrometer with inductively coupled plasma (ICP-OES). The in vitro results show a direct relationship between the amount of clay and release of aluminum, the amount of aluminum in vitro, dependent dissolution medium and observed, an increased release of aluminum (3.057 ± 0.019 mg/L) in simulated intestinal juice and release less (1.533 ± 0.019) at pH 1.2. The in vivo results determine that the administration of doses 1 (Do1) (50 mg/kg) and doses 2 (Do2) (500 mg/kg), produce an exponential increase in the concentration of aluminum in the first 6 hours with peak concentrations of 18,644 ± 0,976 and 21,406 ± 0.968 mg/L respectively, after 8 hours, the decay of the two trend lines indicating that 3 the aluminum concentration in blood decreases with time is evident. It is further noted that the higher the dose administered clay, the greater the amount of aluminum released and therefore the greater is the amount detected in blood. Also, after 24 hours of administration clay, aluminum amounts decrease to values close to baseline Concerning the urine samples, the aluminum concentration at 24 hours, when tested with Do 1, is 8.351 ± 0.298 mg/L, which compared to the maximum concentration of aluminum in blood of the same group, It represents 44.79%, this value represents the percentage of aluminum excreted via urine within 24 hours. Relative to group Do2, the maximum concentration of aluminum excreted renally is 11.257 ± 0.358 mg/L representing a percentage of 52.59% removal within 24 hours. The intake of clay "chaco" and its exposure to changes in pH within the gastrointestinal tract causes the release and absorption of aluminum can cause adverse health effects. 4 CAPITULO I INTRODUCCIÓN El consumo de arcillas por humanos se inició hace más de 500 años y estuvo relacionado con la domesticación de papas nativas las cuales contienen glucoalcaloides (solaninas) que irritan el tubo digestivo en humanos y animales. En la región Puno, las personas del altiplano y también los loros de Tambopata aprendieron con la experiencia que sus problemas gastrointestinales podían aliviarse con el consumo de arcillas. En el altiplano peruano-boliviano existen varios yacimientos de arcillas comestibles de las cuales los principales están ubicados en Ácora, Asillo, Azángaro y Tiquillaca en el Perú; Achocalla, Mocomoco y Oruro en Bolivia. Se cree que estas arcillas están compuestas principalmente por minerales como la montmorillonita, caolinita, illita y cuarzo. En la actualidad estas arcillas son consumidas por los pobladores rurales con frecuencia al finalizar la etapa de cosecha de papas. Es importante mencionar que estas arcillas naturales se comercializan en las ferias y mercados de las ciudades principales de la región sur de nuestro país. 5 OBJETIVOS Objetivo general a) Caracterizar fisicoquímicamente la arcilla comestible “chaco” y la liberación de aluminio en ensayos in vitro - in vivo. Objetivos específicos a) Caracterizar fisicoquímicamente la arcilla “chaco”. b) Estandarizar el método para la determinación de aluminio en ICP-OES. c) Establecer las cinéticas de liberación del aluminio en diferentes medios de disolución. d) Determinar el efecto de la administración de la arcilla “chaco” sobre los niveles de aluminio en sangre y orina en animales de experimentación. 6 HIPÓTESIS “Dado que el chaco es una arcilla compuesta principalmente por aluminio y silicio, capaces de adsorber elementos catiónicos en forma natural y este es consumido tradicionalmente por las poblaciones altiplánicas como parte de su dieta y con fines terapéuticos, es probable que al ser sometida a pH fisiológico pueda liberar elementos traza tóxicos perjudiciales para la salud”. 7 PLANTEAMIENTO TEÓRICO 1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 1.1. Enunciado del problema Caracterización fisicoquímica y liberación de aluminio, in vitro - in vivo, de la arcilla (chaco). 1.2. Descripción del problema El “chaco” (denominación en lengua quechua) o “passa” (lengua aymara) es una arcilla utilizada desde tiempos precolombinos en forma de suspensión para tratar los síntomas de las enfermedades ácido-pépticas y como parte de la dieta nutricional. Por otro lado, el uso de arcilla para fines médicos ha incrementado recientemente por el creciente éxito de los recursos naturales con fines terapéuticos. Sin embargo, la arcilla por su estructura fisicoquímica, alta capacidad de intercambio de iones y una elevada área específica, tiene una gran capacidad de adsorción de elementos trazas tóxicos por lo que el consumo de la arcilla y su subsecuente exposición a cambio de pH propios del tracto gastrointestinal, podría liberar elementos propios de su estructura (aluminio) y/o elementos traza tóxicos pudiendo ocasionar problemas en la salud. Tipo y nivel de investigación: experimental, prospectivo y longitudinal Análisis u operacionalización de variables VARIABLES INDICADORES INDEPENDIENTE  Caracterización  Composición porcentual fisicoquímica de elementos tóxicos  pH y temperatura del  Unidades de pH y °C. medio.  Concentración de aluminio  pH estomacal e intestinal liberado por la arcilla. 8 DEPENDIENTE  Cantidad de elementos  Concentración en ppm traza liberados por la en el medio de prueba arcilla  Cantidad de aluminio  Cinética de liberación liberado en el medio por  Biodisponibilidad de unidad de tiempo elementos traza liberados  Concentración de por la arcilla aluminio en sangre 1.3. Justificación del problema Las razones de la ingesta de arcilla “chaco” no están debidamente justificadas, sin embargo; las influencias tradicionales, psicológicas, medicinales, culturales y religiosas son relevantes en las costumbres geofágicas. La arcilla debido a su estructura (silicatos de aluminio) y composición podría acumular y/o liberar elementos tóxicos para la salud, además esto se agrava si se tiene en cuenta que en nuestro país el hábito geofágico como alimento o con fines terapéuticos se practica en zonas rurales de la región sur sin ningún tipo de control de calidad o información al consumidor. Bajo este esquema la ingesta en forma sistemática del chaco podría conllevar a efectos negativos e irreversibles en la salud y que más halla de remediar algún tipo de malestar, podría provocar intoxicaciones por metales como el aluminio y manganeso, los cuales se caracterizan por ser elementos altamente neurotóxicos (degeneración neuronal, Alzheimer, disfunción motora, problemas de aprendizaje y memoria) además, de producir problemas renales. En consecuencia la cuantificación de elementos traza liberados por la arcilla sometidas a cambios de pH fisiológico mediante ensayos de disolución y su posterior estudio de biodisponibilidad en animales de experimentación es importante para evaluar la seguridad de la práctica geofágica en nuestro país. 9 CAPITULO II MARCO CONCEPTUAL Desde la prehistoria, los seres humanos han utilizado arcillas con fines terapéuticos.1-3 Hay indicios de que el Homo erectusand y Homo neanderthalensis usaron mezcla de ocres con agua y diferentes tipos de lodos para curar heridas, calmar irritaciones, como un método de limpieza de la piel, etc.1 La geofágia, se produce en todo el mundo en una variedad de grupos étnicos, religiosos y sociales y se ha documentado ya desde 1398,4, 5 además, la geofágia es una conducta humana común entre niños pequeños y mujeres embarazadas que implica la ingestión de sustancias terrosas tales como el suelo y arcilla. Varios estudios coinciden en que este comportamiento tiene sus raíces en la evolución y es común entre el reino animal.6-9 Sin embargo, la geofágia se considera como un comportamiento aberrante, y potencialmente peligrosa debido a la contaminación con tóxicos constituyentes tales como metales, metaloides, parásitos, patógenos o contaminantes orgánicos persistentes, como PCDD (dibenzo-p-dioxinas y dibenzofuranos policlorados). 10-13 1.1. Geomedicina Los términos geomedicina y Geoquímica Ambiental se han utilizado tradicionalmente. Selinus14 en 1931, fue el primero que introdujo el término 10 geomedicina, y consideró que era sinónimo de Medicina Geográfica, el cual es definido como "una rama de la medicina, donde geográfica y los métodos cartográficos se utilizan para presentar resultados de investigación médica”15 Además algunos autores señalan que los profesionales de la Geología Médica están involucrados en tareas como: ¯ La identificación de causas ambientales sobre posibles problemas de la salud, a fin de buscar soluciones para prevenir o minimizar estos problemas. ¯ La identificación de contaminantes geoquímicos en suelos, sedimentos, y aguas que pueden impactar en la salud de forma negativa. ¯ La evaluación de efectos beneficiosos para la salud de geo-materiales y sus procesos.16 Por otro lado, La geofágia o comúnmente llamado pica, es el hábito de consumir arcilla o tierra y ha sido practicada por la humanidad en la mayoría de las culturas en muchos continentes y por un largo periodo de tiempo (documentado desde 1398) 4, 7, 17-19 y nuestro país no es ajeno a ello. Finalmente es importante menciona que, la arcilla es una roca natural de granos finos 20 o material sólido que contiene uno o más minerales con trazas de óxidos metálicos y materia orgánica. Algunos trabajos indican que la arcilla debe ser reconocida como el material del siglo 21 debido a su abundancia natural, bajo costo y amigable con el medio ambiente.21-23 Sin embargo, el uso de arcillas con fines terapéuticos y cosméticos debe cumplir con ciertos requisitos físicos, fisicoquímicos y microbiológicos 1.2. Arcilla Definición La arcilla se define como un grupo de minerales secundarios microcristalinos que consisten en silicatos de aluminio hidratados que tienen estructuras en forma de hoja o lamina. 11 Los minerales arcillosos se distinguen uno de otros por la fórmula química general, la estructura y las propiedades químicas y físicas. Los tres grupos de minerales arcillosos son los siguientes: - Grupo de la montmorillonita, Al2(OH)2SiO10 - Grupo de la illita, K0-2Al(Si8-6Al0-2)O20(OH)4 - Grupo de la caolita, Al2 SiO5(OH)4 Muchas arcillas contienen grandes cantidades de sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, así como cantidades traza de otros metales.24 Estructura La estructura en capas de la arcilla consiste en láminas de óxido de silicio que alternan con láminas de óxido de aluminio. Las láminas de óxido de silicio están constituidas por tetraedros en los que cada átomo de silicio está rodeado por cuatro átomos de oxígeno. En cada tetraedro, tres son compartidos con otros átomos de silicio que son componentes de otro tetraedro. Esta lámina u hoja se denomina lámina tetraédrica.24, 25 El óxido de aluminio está contenido en una lámina octaédrica, así llamada porque cada átomo de aluminio está rodeado por seis átomos de oxígeno en una configuración octaédrica.26, 27 Clasificación estructural de la arcilla Estructuralmente las arcillas pueden clasificarse como: - Arcillas de capas unitarias - Arcillas de dos capas en la que los átomos de oxigeno son compartidos entre una lámina tetraédrica y otra octaédrica adyacente - Arcillas de tres capas en que una lámina octaédrica comparte átomos de oxigeno con láminas tetraédricas a ambos lados 12 Una capa unitaria de una arcilla de dos capas tiene típicamente alrededor de 0.7 nanómetros (nm) de espesor, mientras que el espesor de una arcilla de tres capas es mayor de 0.9 nm.27 Propiedades físico-químicas Las propiedades de la arcilla derivan principalmente del: ¯ Tamaño de partícula ¯ Morfología laminar (filosilicatos) ¯ Las sustituciones isofórmicas, que dan lugar a la aparición de cargas en las láminas y a la presencia de cationes débilmente ligados en el espacio inter-laminar Como consecuencia de estas características, las arcillas presentan una elevada área superficial y elevada capacidad de adsorción,28, 29 además, la presencia de una gran cantidad de superficie activa con enlaces no saturados por lo que pueden interaccionar con diversas sustancias, en especial compuestos polares, esta propiedad se conoce como capacidad de intercambio iónico.29 Superficie específica También llamada área específica, se define como el área de la superficie externa más el área de la superficie interna (si existe) de las partículas constituyentes, por unidad de masa, expresado en m3/g. Las arcillas poseen una elevada superficie específica,30 muy importante para ciertos usos industriales como su aplicación en envases de alimentos.31 Algunos ejemplos de superficie específica de las arcillas son por ejemplo:29 ¯ Caolinita de elevada cristalinidad 15 – 50 m2/g. ¯ Illita 50 m2/g. ¯ Momtmorillonita 80 – 300 m2/g. ¯ Sepiolita 100 - 240 m2/g. ¯ Paligorskita 100 – 200 m2/g. 13 Capacidad de intercambio catiónico La capacidad de intercambio catiónico (CEC) se define como la suma de todos los cationes de cambio, que un mineral puede adsorber a un determinado pH. Es equivalente a la medida del total de cargas negativas del mineral. Estas cargas negativas pueden ser generadas en tres formas diferentes:29, 31 ¯ Enlaces insaturados ¯ Sustituciones isomórficas dentro de la estructura ¯ Disolución de los grupos hidroxilos accesibles 1.3. Ensayos in vitro El ensayo de disolución permite medir la velocidad y la magnitud de la disolución de un analito en un sistema de ensayo “in vitro”, dentro de un periodo de tiempo específico y en un volumen determinado de medio de disolución, en el cual se introduce una cantidad de muestra sólida, posteriormente el medio es agitada bajo condiciones controladas. Durante todo el periodo de ensayo se toman muestras con o sin reposición de otro medio que se encuentra bajo las mismas condiciones.32 La velocidad de disolución por lo general se expresa como la masa de soluto que aparece en el medio de disolución por unidad de tiempo. La velocidad de disolución está influenciada por las propiedades intrínsecas del estado sólido, tal como el estado cristalino, incluyendo polimorfos y solvatos así como el grado de no cristalidad. Por otro lado, las propiedades de disolución también se ven influenciadas por factores extrínsecos como el área superficial, la hidrodinámica y las propiedades del medio de disolución, incluyendo el disolvente, la temperatura, la viscosidad del líquido, el tiempo, el pH y concentración de la solución amortiguadora.33 Actualmente la USP 35, reconoce 7 métodos para el ensayo de disolución: los más utilizados son el método N°1, también referido como el método de la Canastilla y el método N°2 o método de la paleta. 14 En relación al medio de disolución, típicamente este se puede desarrollar en medios acuosos, pero también se pueden simular condiciones in vivo en donde las mediciones se pueden realizar en intervalos fisiológicos de pH ± 0.05 a 37 °C ± 0.5. La velocidad típica de rotación puede estar entre 60 y 500 rpm, recomendándose 300 rpm para el disco rotatorio. En relación a los tiempos de muestreo para formas farmacéuticas de liberación inmediata se considera intervalo de 30 - 60 minutos, y para productos de disolución lenta se consideran tiempos mayores a 60 minutos.33, 34 1.4. Ensayos in vivo El uso de animales en experimentación va en paralelo al desarrollo de la medicina, cuyas raíces provienen de la Grecia antigua. Según Baumans (2005) la creciente demanda de modelos animales de calidad, junto con las críticas vertidas sobre el modo en que se utilizan los animales, ha llevado a la aparición de una rama multidisciplinaria de la ciencia denominada ciencia de los animales de laboratorio, que se rige por los principios cardinales de las tres erres: reemplazo, reducción y refinamiento, formuladas por Russell y Burch en 1959.35-38 Por otro lado, el uso de animales en la investigación, enseñanza y pruebas, es aceptable solamente si contribuye en forma efectiva a la mejor comprensión de principios biológicos fundamentales, o al desarrollo de conocimientos que, razonablemente, podemos esperar que beneficien a los seres humanos o a los animales.39 1.5. Espectrofotómetro de emisión óptico con plasma inductivamente acoplado ICP – OES Plasma de acoplamiento inductivo (ICP) es una fuente de ionización que junto a un espectrofotómetro de emisión óptico (OES) constituye el equipo de ICP-OES. 15 Es una técnica analítica utilizada para la detección de metales trazas. Es un tipo de espectroscopia de emisión que utiliza el plasma acoplado inductivamente para producir átomos excitados e iones que emiten radiación electromagnética en longitudes de onda característica de un determinado elemento. La temperatura de llama se encuentra en un rango de 6,000 a 10 000 °K.40, 41 La intensidad de esta emisión es indicativo de la concentración del elemento en la muestra. Funcionamiento En esta técnica, la introducción de la muestra líquida en un sistema de nebulización forma un aerosol que es transportado por el Argon a la antorcha del plasma, acoplado inductivamente por radio frecuencia. En el plasma, debido las altas temperaturas generadas, los analitos son atomizados e ionizados generándose los espectros de Emisión atómicos de líneas características. Los espectros son dispersados por la red de difracción y el detector sensible a la luz se encarga de medir las intensidades de las líneas. La información es procesada por el sistema informático.42, 43 2. ANALISIS DE ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS F. TATEO y col. Realizaron estudios de la composición mineralógico y geoquímico de cuatro arcillas minerales de uso terapéutico. La composición del soluto fue Na > Si> Ca> K> Mg. Además, se reporta que las variaciones de la solución química indican que la elementos menos solubles disminuyen con el tiempo de sedimentación (por ejemplo, Fe, Al, Mn): los elementos alojados en materia orgánica o sulfuros y soluble en medios oxidativo, aumenta con el tiempo (V, Mo, Sb, As). Muchos otros elementos son más bien constantes a muy bajo concentraciones.9 C. OFELIA CASTILLO y col., mencionan que los pobladores del altiplano peruano-boliviano consumen una sustancia natural conocida como “chaco”, muy 16 difundida desde la época precolombina y apreciada por sus propiedades digestivas. Dichos investigadores indican que el mecanismo de acción terapéutico (antiácido) se debe a una acción citoprotectora sobre la mucosa gástrica por mecanismos independientes de la inhibición de la secreción ácida, ya que no posee propiedad antiácida in vitro.44 M. ISABEL, indica que la arcilla es usado en formulaciones farmacéuticas, como principios activos administrados por vía oral (protectores gastrointestinales, laxantes osmóticos orales, antidiarreicos) o administrado por vía tópica (protectores dermatológicos, cosméticos); y como excipientes (lubricantes, sistemas de entrega, bases inertes, emulsionantes), principalmente debido a su alta área específica y su capacidad de absorción/adsorción, inercia química y baja o nula toxicidad para el paciente.1 P.S. HOODA y col. Mencionan que a pesar de que los suelos son rico en nutrientes minerales, la ingestión de suelos, accidentales o por medio de geofagia puede reducir potencialmente la absorción de nutrientes ya biodisponibles, en particular los micronutrientes tales como Fe, Cu y Zn in vitro. En el trabajo también se menciona que los suelos ingeridos podrían convertirse en fuente de Ca, Mg y Mn.7 M. SARA y col. Sugieren que las arcillas (in vitro) en general inducen citotoxicidad (con dependencia de la arcilla, la concentración, sistema experimental, etc.) con diferentes mecanismos subyacentes, tales como necrosis/apoptosis, el estrés oxidativo o genotoxicidad. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vivo realizados en roedores, no mostraron evidencias claras de toxicidad sistémica incluso a dosis de 5000 mg/kg.11 D. MWALONGO y N.K. MOHAMMED tras un análisis de 100 arcillas de cinco regiones en Tanzania, reportaron que en las muestras se identificaron 17 elementos esenciales como Fe, Zn, Cu, Se y Mn y elementos tóxicos como As, Pb, Co, Ni, U y Th cuyas concentraciones estaban por encima de los límites permisibles de la OMS en algunas de las muestras. Además, los resultados de este estudio muestran que el hábito de comer tierra está exponiendo a las madres embarazadas y sus hijos a la toxicidad de los metales por lo que podrían producir efectos perjudiciales a su salud.3 18 CAPITULO III I. PLANTEAMIENTO OPERACIONAL 1. TÉCNICAS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DE VERIFICACIÓN 1.1. Instrumentos, materiales y reactivos Instrumentos y materiales - Balanza analítica Ohaus Pioneer - Equipo EASY pure II - Micropipetas 20, 200 y 1000 uL - Pipeta de 1, 5 y 10 mL - Tips - Tubos Falcon de 15 y 50 mL - Fiolas de 10, 25, 500 mL - Papel filtro rápido - Digestor microondas MARS 6 CEM - Digestor UV Metrohm - Espectrofotómetro de emisión óptica con plasma inductivamente acoplado ICP – OES, PerkinElmer - Equipo de disolución ERWEKA DT 600 Reactivos - Ácido nítrico suprapuro Merck - Ácido fosfórico p.a. Merck - Ácido clorhídrico p.a. Merck 19 - Ácido acético p.a. Merck - Hidróxido de sodio p.a. Merck - Solución estándar de aluminio Merck 1.2. Validación del método en el espectrofotómetro de emisión atómica con plasma inductivamente acoplado La validación de métodos es considerado como las diferentes actividades que se realizan repetidas veces, a intervalos relativamente infrecuentes, durante la vida útil de un método.45 La técnica de espectrofotometría de emisión atómica con plasma inductivamente acoplado es frecuentemente utilizada en la determinación de metales pesados en diferentes matrices.46 La principal ventaja es que se trata de una técnica multielemental que combina cualidades como un bajo límite de detección, alta capacidad para determinar en forma simultánea, precisa y en corto tiempo un amplio número de analitos.47 Según la información emitida por el EPA 200.7 y con la finalidad de obtener resultados confiables, se verificará la metodología considerando los siguientes parámetros Linealidad La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta. Para su determinación se prepara una serie de al menos cinco diluciones de un estándar. Estas diluciones son analizadas y se determina la curva de regresión Y=bX+a. Los valores de a y b son los estimadores del intercepto del origen y la pendiente respectivamente.48 Independiente a la apariencia de la recta, resulta conveniente evaluar los estimadores de regresión en un intervalo de confianza dado (p=0.05): 20 - Coeficiente de regresión: se determina para evaluar el ajuste del modelo lineal propuesto, Y=bX+a - Pendiente (b): se determina como parámetro indicativo de la sensibilidad del método o para evaluar la correlación de diferentes métodos. - Ordenada o intercepto del origen (a): se determina para evaluar la proporcionalidad de la función analítica, es decir, que la recta pase por el origen y que cualquier desviación pueda adjudicarse únicamente a un error aleatorio.48 Precisión Refleja la medida en que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea son semejantes entre sí. Aunque la USP XXII2 expresa que la precisión es la expresión del grado de la reproducibilidad, mientras que la Norma Británica17 incluye la repetibilidad y la reproducibilidad.49 Exactitud También conocido como error sistemático o tendencia, corresponde a la diferencia entre el valor obtenido (muestra enriquecida con una concentración conocida de estándar (1ppm)) y el valor verdadero (concentración conocido del estándar (1ppm)).48 Sensibilidad Método analítico que corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. Los parámetros a definir al evaluar la sensibilidad son los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC). El LD hace referencia a la mínima cantidad de analito que se puede detectar en la matriz; mientras que el LC es la mínima cantidad de analito que se puede cuantificar en la matriz.48 21 Según el METHOD 200.7 del EPA relacionado a la “determination of metals and trace elements in water and wastes by inductively coupled plasma- atomic emission spectrometry” para determinar el LD y LC se debe leer el blanco 5 veces, hallar la desviación estándar y multiplicarla por 3 para hallar el LD y por 10 para el LC.50 1.3. Metodología 1.3.1. Obtención y caracterización de la arcilla El chaco se extraerá de alguno de los yacimientos identificados en la región de Puno (Acora, Asillo, Azangaro y Tiquillaca). Los cuidados durante la extracción de la arcilla implicará el uso de EPP (Equipo de Protección Personal) En relación a la extracción, manejo y conservación de la arcilla, se requerirá una lampa y pico para realizar este trabajo, además la arcilla a extraer no debe presentar ninguna coloración o manchas en la superficie ni dentro de la estructura de la arcilla. Caracterización química de la arcilla Triturar y pesar 200 mg de arcilla, en el vaso de teflón adicionar 2ml de ácido nítrico supra-puro Merck concentrado. Digerir la muestra según el método EPA-3051 estipulada en el digestor Mars 6 cuyas características son: - Tiempo de calentamiento: 4 minutos y 30 segundos - Temperatura máxima alcanzado: 175°C - Tiempo de mantenimiento: 5 minutos y 30 segundos - Tiempo de enfriamiento: 15 minutos - Potencia máxima: 400 w 22 Caracterización física de la arcilla Realizar una inspección visual de la arcilla descartando aquellas que presenten coloraciones extrañas impropias de la arcilla comestible. Para medir el pH, pesar 4 gramos de arcilla y añadir 10 mL de agua tamponada a pH neutro. Realizar el análisis granulométrico luego del lavado de la arcilla y obtener tamaños de partículas de 75 µm - 150 µm. Lavado de la arcilla Colocar 350 gramos de arcilla en un vaso de precipitados de 500 mL de capacidad, adicionar agua ultrapura y homogenizar, dejar en reposo 24 horas, colectar la fase que contiene la arcilla en suspensión y centrifugar a 6000 rpm por 5 minutos, llevar la masa obtenida a la estufa a 60°C por 24 horas.6, 25, 51, 52 Finalmente triturar y tamizar. 1.3.2. Ensayos in vitro - perfiles de disolución Desarrollo del perfil de disolución a pH 1.2 a) Condiciones de ensayo Aparato: paletas; 250 rpm Cantidad de muestras: 50, 250, 500 mg Temperatura: 37 °C Tiempo: 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos Medio: solución de pH 1.2; Fluido gástrico simulado USP sin enzima: 900 mL  Fluido gástrico sin enzimas.- disolver 2.0 gramos de cloruro de sodio en 7 mL de ácido clorhídrico concentrado y cantidad suficiente de agua ultrapura para 1000 mL Desarrollo del perfil de disolución a pH 4.5 a) Condiciones de ensayo Aparato: paletas; 250 rpm 23 Cantidad de muestras: 50, 250, 500 mg Temperatura: 37 °C Tiempo: 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos Medio: solución amortiguadora de acetato de sodio pH 4.5: 900 mL Desarrollo del perfil de disolución a pH 6.8 a) Condiciones de ensayo Aparato: paletas; 250 rpm Cantidad de muestras: 50, 250, 500 mg Temperatura: 37 °C Tiempo: 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos Medio: solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6.8: 900 mL Desarrollo del perfil de disolución en jugo gástrico simulado a) Condiciones de ensayo Aparato: paletas; 250 rpm Cantidad de muestras: 50, 250, 500 mg Temperatura: 37 °C Tiempo: 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos Medio: jugo gástrico simulado 900 mL  Jugo gástrico simulado: pesar 12.0 g de cloruro de sodio y 19.2 g de pepsina purificada en 18 mL de ácido clorhídrico y agua cantidad suficiente para 6000 mL. Ajustar el pH a 1.45 con ácido clorhídrico Desarrollo del perfil de disolución en jugo intestinal simulado a) Condiciones de ensayo Aparato: paletas; 250 rpm Cantidad de muestras: 50, 250, 500 mg Temperatura: 37 °C Tiempo: 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 minutos 24 Medio: jugo intestinal simulado 900 mL  Jugo intestinal simulado: pesar 6.8 g de fosfato monobásico de potasio en 250 mL de agua, agregar 190 mL de hidróxido de sodio 0.2 N y 400 mL de agua. Agregar 10.0 g de pancreatina, ajustar el pH con hidróxido de sodio 0.2 N a pH 7.5 ± 0.1. enrazar con agua a volumen final de 1000 mL Tratamiento de las muestras Extraer alícuotas de 5 mL de cada vaso de disolución a los tiempos antes indicados (con reposición de medio), enrasar a un volumen final de 10 mL con ácido nítrico al 3 % y filtrar con papel filtro rápido. La cantidad de aluminio liberado será determinado en el ICP – OES utilizando como blanco el medio de disolución correspondiente. 1.3.3. Ensayos in vivo Se optará por cumplir con las condiciones mínimas necesarias que garantice el uso adecuado de los animales de experimentación y para la obtención de resultados confiables. Características del modelo animal Definir las condiciones de los animales en cuanto a características somáticas, peso, sexo y edad. Se utilizaran un total de 24 ratas machos albinas Wistar de la especie Rattus norvegicus provenientes del Bioterio de la Universidad Católica de Santa María (UCSM). Los animales serán divididos al azar en tres grupos de experimentación (tabla N° 2), además para la estadía de las ratas se diseñaran jaulas individuales de 18 cm de ancho, 25 cm de largo y 20 cm de altura de tal manera que se garantice un espacio adecuado para el libre movimiento de los animales. 25 Los ratas serán ambientados 15 días antes del desarrollo del ensayo alimentándolos con maíz, trigo y agua ad libitum. Además, el diseño en general contará con las siguientes características. a) Equipo de investigación (personas que manipularán los animales) Nombre Profesión Investigador Cargo Técnico Experienci de a en el uso apoyo de animales Celia Química X Estudiante de X Choquenaira farmacéutica posgrado Gonzalo Químico X Asesor de tesis X Dávila farmacéutico José Químico X Co-asesor X Villanueva farmacéutico José Aita Encargado Encargado del X X (2 años) Fuente del bioterio bioterio de la de la UCSM UCSM Justo Aita Ex- Ex-encargado X X (35 años) Aragon encargado del bioterio de del bioterio la UCSM de la UCSM b) Naturaleza de trabajo Tesis de maestría c) Duración estimada del tiempo de trabajo con los animales: 25 días continuos. Características Días Tiempo de ambientación 15 Toma de muestra (sangre) 1 Toma de muestra (orina) 4 Total 20 d) Animales requeridos Especie Rattus norvegicus Cepa/colonia Wistar 26 Sexo Macho Edad 6 meses Peso (g) 225 ± 5 Procedencia Bioterio de la UCSM e) Propuesta y tipo de estudio Prueba Entrenamiento Investigación X Producción y crianza de animales f) Procedimientos Cirugía menor Cirugía mayor Múltiples cirugías Colección in vivo de sangre X Colección de orina X g) Procedimientos experimentales Ayuno X Restricción hídrica X  Intervalos cortos de tiempo Inmovilización del animal Anestesia Cirugía h) Exposición a agentes químicos/ físicos/ biológicos/ mecánicos Si X No - ¿Cuál?:Arcilla comestible “chaco” - Dosis: 50 y 500 mg / kg de peso. 27 - Frecuencia de administración: una vez i) Extracción de fluidos Si X No - ¿Cuál?: sangre - Vía: plexo venosos retro orbital - Volumen: 200 µL - Frecuencia (h): 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18, 24. j) Extracción de órganos Si No X k) Destino final de los animales Eutanasia Recuperación de los animales X Previo al tratamiento de los animales de experimentación, se determinarán las concentraciones basales de posibles elementos traza en las muestras sanguíneas Tabla N°2. Grupos de trabajo y tipo de tratamiento Grupo Tratamiento Control negativo 2 mL de agua ultrapura en ayunas Do 1 50 mg de arcilla por kg de peso en ayunas Do 2 500 mg de arcilla por kg de peso en ayunas Con la finalidad de determinar la biodisponibilidad de los elementos traza, se extraerán muestras de sangre en diferentes tiempos como se muestra a continuación. 28 Tabla N°3. Tiempos de toma de muestra sanguínea Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tiempo (h) 0 1 2 4 6 8 10 14 18 24 Por otro lado, con la finalidad de determinar la cantidad de analito que se podría estar excretando, se recolectarán muestras de orina a las 24, 48, 72 y 96 horas. Obtención y tratamiento de muestras biológicas Sangre Extraer del plexo venoso retro orbital 200µL de sangre, recolectarlos y rotularlos en envases de polietileno con cierre seguro hermético (Eppendorf). Usar EDTA al 10% como anticoagulante en los tiempos antes mencionados. Medir 100 µL de sangre de cada muestra y depositarlos en tubos de cuarzo, posteriormente agregar 20 µL de peróxido de hidrogeno, 100 µL de ácido nítrico y 5 mL de agua ultrapura para continuar con la digestión como se describe a continuación. Colocar la batería de tubos en el sistema de digestión UV, programar el temporizador para 1 hora de digestión, controlar la temperatura para no sobrepasar los 95 ºC. Concluida la digestión enrazar las muestras en fiolas de 10 mL con agua ultrapura para su posterior medición por ICP-OES. Orina Obtener las muestras de orina mediante el uso de una bolsas de polietileno (colector de orina), el cual será colocada debajo de cada jaula, las muestras de orina que se depositen en el pliego de la bolsa de polietileno, serán recolectadas con una jeringa y colocados en un envases de polietileno con cierre seguro hermético (Eppendorf). La toma de muestra se realizará cada 5 horas durante el día y cada 12 horas por las noches por un periodo total de 4 días. Para el análisis de las muestras, 29 medir 200 µL de orina y enrazar con ácido nítrico suprapuro al 3% hasta un volumen final de 10 mL, filtrar y analizar por ICP-OES. Jaula Bolsa de polietileno Diseño de jaula individual con colector de orina 1.3.4. Cálculos y análisis estadísticos El tratamiento de los datos estadístico se realizarán atreves del análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba post-hoc de Tukey HSD. Para determinar las ecuaciones que describen los perfiles de disolución y biodisponibilidad in vitro e in vivo se utilizará el software OriginPro 9.0. Los parámetros cinéticos como el tiempo medio de absorción (T1/2 abs.), tiempo medio de eliminación (T1/2 e), constante de absorción (kabs.) y constante de eliminación (ke), se determinarán a través del método de residuales. Los parámetros de biodisponibilidad como concentración máxima (Cmax (mg/L)) y el área bajo la curva (AUC (mg.h/L)), se hallarán por el método de integración de trapecios. 2. CAMPO DE VERIFICACIÓN 2.1. Ubicación espacial La identificación, cuantificación y estudios toxicológicos se realizaran en el laboratorio H-101, H-202 y el bioterio de la Universidad Católica de Santa María de la ciudad de Arequipa. 30 2.2. Ubicación temporal El trabajo de investigación se realizará durante el año 2015 y parte del 2016. 3. ESTRATEGIA DE RECOLECCIÓN DE DATOS Los datos serán procesados y obtenidos haciendo uso de modelos estadísticos acorde con el tipo de ensayo. 31 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el presente capitulo se reportaran y discutirán los resultados hallados durante el desarrollo de la metodología descrita en capítulos anteriores. 1. RECOLECCIÓN DE LA ARCILLA La muestra fue recolectada de uno de los yacimientos identificados a 8 Km de la comunidad de Chacowasi (Chaupi sawacasi – Tawacachi), en la provincia de Azángaro (latitud 14°54'27'' S, longitud 70°11'49'' W), departamento de Puno. Figura 1. Arcilla extraída 32 Para la extracción de la arcilla se usaron EPP (Equipo de Protección Personal). En relación a la extracción, manejo y conservación de la arcilla, se requirió lampa y pico para realizar el socavón a 3 metros de profundidad aproximadamente, además, se tuvo cuidado de que la arcilla extraída no presentase ninguna coloración o manchas en la superficie ni dentro de su estructura de la arcilla. 2. CARACTERIZACIÓN DE LA ARCILLA 1.1. Lavado de la arcilla Luego de analizar y probar diferentes técnicas de lavado, la arcilla fue triturada y se colocó 350 gramos en un vaso de precipitados de 500 mL de capacidad, se adicionó agua ultrapura, se homogenizó y se dejó en reposo durante 24 horas para la separación de las partículas de la arcilla.53 Luego de este tiempo, se observó la formación de dos capas, en seguida se colectó el sobrenadante y se centrifugó25, 53 a 6000 rpm por 5 minutos, la masa obtenida se llevó a estufa a 60 °C por 24 horas.6, 25, 51, 52 Finalmente la muestra fue nuevamente triturada y tamizada obteniéndose tamaños de partícula > 75 µ < 150 µ. (ANEXO 1) 1.2. Caracterización fisicoquímica En relación a la caracterización física de dicho material, este tiene una apariencia de roca blanquecina, de superficie lisa y se caracteriza por adquirir plasticidad al ser mezclada con agua, además presenta un pH de 6.5 similar resultado se hallaron en trabajos relacionados a la caracterización y evaluación de la actividad terapéutica de arcillas.54 En relación a la caracterización química, este se realizó con arcilla directamente extraída de los yacimientos, por lo que para la determinación de los elementos presentes en la tabla 1 se determinó tras la digestión ácida de la arcilla según el 33 método EPA-3051 del digestor Mars 6, posteriormente la muestra fue filtrada y analizada en el ICP-OES cuya configuración metodológica para la determinación de metales es el EPA 200.7 validada por el área de control de calidad de la Universidad Católica de Santa María. Tabla 1. Caracterización química de la arcilla Elementos mg/L Elementos mg/L Ag 328.068 2.50 Mg 279.077 8760.00 Al 308.215 17345.00 Mn 257.610 1352.50 As 193.696 85.25 Mo 203.845 1.50 B 249.677 17.25 Na 589.592 4197.50 Ba 493.408 646.00 Ni 231.604 0.00 Be 313.107 0.00 P 214.914 0.00 Bi 223.061 3.75 Pb 220.353 39.00 Ca 315.887 8172.50 Sb 206.836 2.75 Cd 228.802 4.50 Se 196.026 0.50 Co 228.616 9.00 Si 251.611 1558.25 Cr 205.560 16.00 Sn 189.927 0.25 Cu 324.752 72.00 Sr 407.771 262.25 Fe 259.939 77875.00 Ti 334.940 264.50 Hg 253.652 6.25 Tl 190.801 0.00 K 766.490 4465.00 V 292.464 22.50 Li 670.784 6.75 Zn 213.857 201.50 Xy: donde X metal; y longitud de onda. En la tabla 1. Se muestra las concentraciones halladas de 32 elementos, en el cual se evidencian elevadas concentraciones de minerales y micro elementos como magnesio, sodio, calcio, cobre, hierro, manganeso, zinc y selenio. Sin embargo, también se evidencian concentraciones elevadas de otros elementos cuyas funciones benéficas fisiológicas no están documentadas y por el contrario, podrían ocasionar efectos negativos en la salud y el medio ambiente si estos son liberados o se hacen biodisponibles.7, 9, 19, 51 34 3. VALIDACIÓN DEL MÉTODO EN EL ESPECTROFOTÓMETRO DE EMISIÓN ATÓMICA CON PLASMA INDUCTIVAMENTE ACOPLADO (ICP OES) PARA LA DETERMINACIÓN DE ALUMINIO La técnica de espectrofotometría de emisión atómica con plasma inductivamente acoplado es frecuentemente utilizada en la determinación de metales pesados en diferentes matrices.46 La principal ventaja es que se trata de una técnica multielemental que combina cualidades como un bajo límite de detección, alta capacidad para determinar en forma simultánea, precisa y en corto tiempo un amplio número de analitos.47 Los métodos de preparación de muestras para la determinación de diferentes elementos en ICP-OES, deben tener en cuenta la complejidad y estabilidad de la matriz de la muestra. Estos métodos incluyen digestión por microondas asistida, hot plate - stirrer, y técnicas de pre- concentración, entre otras como digestión UV.46 Por otro lado, si bien es cierto que la digestión de las muestras permiten la destrucción de la materia orgánica, es un paso crítico en el análisis elemental, debido al riesgo de contaminación y pérdida de analitos, contribuyendo a un error de análisis sistemático.55 Con el fin de obtener resultados confiables y reproducibles, se realizaron ensayos de linealidad, precisión, exactitud, % de recuperación, límite de cuantificación y límite de detección del método en el ICP-OES para la determinación de aluminio. Todo lo anterior se realizó según la información emitida por la por el EPA 200.7. Los resultados que se muestran a continuación se obtuvieron según el medio de disolución al cual fue sometida la arcilla (pH 1.2; 4.5; 6.8; jugo gástrico e intestinal simulado) y según el blanco de cada matriz analizado (blancos de matrices sangre y orina). 3.1. Linealidad La linealidad de la respuesta del equipo, se realizó utilizando el estándar de Al(NO3) Merck a diferentes concentraciones en solución ácida suprapuro (HNO3 35 3%) como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 1 considerando la concentración de aluminio como variable independiente (x) y la intensidad como variable dependiente (y). Tabla 2. Datos para la determinación de la linealidad del método. [Al] Ia (A) Ib (A) Ic (A) Prom. DSR (ppm) (A) 0.1 108970.900 106061.700 106586.900 107206.500 1.446 0.3 133673.900 130738.300 130589.300 131667.167 1.321 0.6 170001.400 165178.700 163914.000 166364.700 1.931 0.9 210908.900 205781.100 203005.900 206565.300 1.941 1.5 280009.200 275521.200 273555.400 276361.933 1.197 2.0 344500.000 337564.600 341717.400 341260.667 1.023 El rango de trabajo se seleccionó tomando en cuenta valores provenientes de las pruebas piloto realizados previamente. Por regresión lineal, a partir de las concentraciones crecientes de estándar de aluminio y los valores promedio de las intensidades, se obtuvo un coeficiente de determinación (R2) de 0.99968, una pendiente (b) de 122755.257 y un intercepto de (a) de 94424.647. 400000 350000 300000 250000 200000 150000 y = 122755.259x + 94424.647 100000 R² = 0.99968 50000 0 0 1 2 Al (ppm) Figura 2. Gráfica de la calibración para aluminio 36 I (A) La pendiente es una medida de la sensibilidad del procedimiento, por lo que mientras mayor es la respuesta del instrumento a un cambio en la concentración del analito, mayor es la sensibilidad del procedimiento.45 Por otro lado, el valor del intercepto indica el error sistémico. El coeficiente de determinación advierte de la relación lineal y no de las variables y el criterio de aceptación se estableció en R2 ≥ 0.995,45, 56 lo cual implica que el modelo es lineal y explicativo en al menos un 99.5%. Cabe resaltar que el valor hallado para el coeficiente fue mayor al valor impuesto (R2 = 0.99968). (ANEXO 2) Tabla 3. Determinación de la linealidad para los datos de la gráfica de regresión Estadística de regresión Coeficiente de correlación múltiple 0.99984 Coeficiente de determinación R2 0.99968 R2 ajustado 0.99960 Error típico 1781.879 Observaciones 6 Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es R2, por lo que para corroborar si el modelo es significativo o no, se realizó una análisis de varianza (ANOVA) asumiendo un nivel de confianza del 95 % en donde se comparan las variaciones de la variables dependiente e independiente.57 El hecho que la probabilidad de rechazar la hipótesis de no diferencia sea tan baja (3.763E-08) hace que se pueda aceptar la diferencia significativa evaluada por lo tanto el modelo es suficientemente explicativo. Por lo que se puede determinar que en el método existe una relación directamente proporcional entre la concentración del analito y la intensidad en el rango de trabajo que se ha establecido. 37 Tabla 4. Análisis de varianza para la determinación de la linealidad Grados de Promedio de los Valor crítico libertad Suma de cuadrados cuadrados F de F Regresión 1 40083149231.842 40083149231.842 12624.243 3.763E-08 Residuos 4 12700373.142 3175093.285 Total 5 40095849604.984 Error Estadístico Inferior Superior Inferior Coeficientes típico t Probabilidad 95% 95% 95.0% Intercepción 94424.647 1223.125 77.200 1.687E-07 91028.708 97820.585 91028.708 [Al] ppm 122755.257 1092.540 112.358 3.763E-08 119721.879 125788.635 119721.879 3.2. Precisión La precisión del método, que se define como la cercanía de concordancia entre los resultados de pruebas independientes entre sí, fue determinada en términos de desviación estándar relativa (RSD) o el coeficiente de variación (%CV)45. La precisión del método se evaluó como la repetibilidad y reproducibilidad de los resultados. La Repetibilidad (precisión intraensayo) refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un periodo de tiempo,49, 58 es así que este parámetro se halló de los datos obtenidos al realizar 5 repeticiones de 1 ppm de Al(NO3) en solución ácida (HNO3 3%), la muestras se analizaron en el mismo día por un analista. Tabla 5. Datos para la precisión del método Elemento Valor certificado Valores prácticos Promedio práctico RSD 1.085 1.090 Aluminio 1 ppm 1.069 1.084 0.760 1.087 1.087 38 El criterio de aceptación del % CV es de ± 2 %47, 59 por lo que analizando nuestros resultaos podemos indicar que el método propuesto es preciso. La reproducibilidad no fue analizada porque no se cuenta con otro equipo ICP- OES por el momento. 3.3. Exactitud La exactitud del método fue determinada al utilizar un estándar de aluminio de concentración conocida. Matemáticamente suele expresarse como desviación relativa porcentual y el porcentaje de recuperación.48 Tabla 6. Porcentaje de recuperación de aluminio en los diferentes medios de disolución RSD % Recuperación pH 1.2 1.783 103.18 pH 4.5 1.505 103.60 pH 6.8 1.006 102.46 Jugo gástrico simulado 1.495 102.48 Jugo intestinal simulado 1.268 101.27 Sangre 1.621 102.32 Orina 1.573 100.20 Los porcentajes de recuperación fueron determinados para cada medio utilizado en la pruebas in vitro e in vivo, es así que, se eligió una muestra a azar en cada caso y se enriquecido con 1 ppm del estándar de aluminio. La tabla 6 muestra los resultados obtenidos. Al igual que en la precisión los criterios de aceptación de la RSD es de ± 2 %47; en relación al porcentaje de recuperación, el rango aceptable es de 100 ± 5 %, por lo que analizando nuestros resultaos podemos indicar que el método propuesto es exacto. 39 Blanco Medio de de disolución matrices 3.4. Sensibilidad Para la evaluación de los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) se utilizaron blancos de cada medio al cual fue sometida la arcilla (pH 1.2; 4.5; 6.8; jugo gástrico e intestinal simulado) y blancos de cada matriz analizados (matrices sangre y orina). Los LD se calcularon como 3 veces la desviación estándar, mientras que los LC se hallaron como 10 veces la desviación estándar para las mismas concentraciones traza del analito.45, 55, 56, 59-61 Los valores de LD y LC se encuentran un rango entre 0.010–0.034 ppm y 0.034–0.113 ppm respectivamente, es claro que estos valores varían dependiendo de los tipos de blancos que se generaron durante el desarrollo del presente trabajo. Tabla 7. LD y LC de aluminio en los diferentes medios de disolución Medio de disolución LD (ppm) LC (ppm) pH 1.2 0.018 0.059 pH 4.5 0.023 0.077 pH 6.8 0.030 0.099 Jugo gástrico simulado 0.026 0.087 Jugo intestinal simulado 0.034 0.113 Sangre 0.027 0.089 Orina 0.010 0.034 4. ENSAYOS In vitro La arcilla es una roca natural de granos finos20 o material sólido que contiene uno o más arcillas minerales con trazas de óxidos metálicos y materia orgánica. Algunos trabajos indican que la arcilla debe ser reconocida como el material del siglo 21 debido a su abundancia natural, bajo costo y compatible con el medio ambiente.21-23 40 Blanco de Medio de matrices disolución El consumo de arcilla en el Perú se inició hace más de 500 años y estuvo relacionado con la domesticación de la papa nativa que contienen glucoalcaloides que irritan el tubo digestivo.44 La arcilla comestible cuya denominación en lengua quechua es “chaco” y “passa” en lengua aymara, es un tipo de arcilla utilizada desde tiempos precolombinos en forma de suspensión para tratar los síntomas de enfermedades ácido-pépticas principalmente,3, 44, 62 sin embargo es importante mencionar otros usos terapéuticos de la arcilla como la disentería, suplemento nutricional, para combatir la anemia, antidiarreico, antimicrobiano y para el tratamiento de parásitos intestinales.7-9, 19, 53, 54 La ingestión de suelo no está científicamente sustentada sin embargo, se cree que el hábito está influenciado por tradiciones, medicinales, culturales, religiosas y creencias psicológicas.4, 6 Sin embargo, la arcilla considerada como el primer material utilizado por el hombre con fines terapéuticos no ha recibido suficiente interés en los libros23 en ese sentido, la concentración de metales consumidos por geofágia individual sigue sin conocerse, es por ello que la cuantificación de elementos esenciales y sobre todo tóxicos es importante para asegurar la seguridad de la práctica geofágica en nuestro país. Considerando las formas de consumo de la arcilla en estudio, se optó por evaluar la liberación de aluminio de la arcilla utilizando tres medios de disolución similar a como se desarrollan los perfiles de disolución de medicamentos y según lo recomendado por el comité de expertos de la Organización Mundial de la Salud en la sección de preparaciones farmacéuticas (Reporte 937 – Informe 40) entre otros.63 Además, considerando que el consumo de arcilla es principalmente vía oral, adicionalmente se optó por determinar la liberación de aluminio en jugo gástrico e intestinal simulada.7, 8, 64 4.1. Pruebas de disolución Actualmente la USP 35, reconoce 7 métodos para el ensayo de disolución: los más utilizados son el método N°1, también referido como el método de la Canastilla 41 y el método N°2 o método de la paleta. Para el desarrollo del presente trabajo se utilizó el método N°2. En relación al medio de disolución, típicamente este se puede desarrollar en medios acuosos, pero como se trata de simular el efecto de la liberación de aluminio durante la práctica geofágica, se trató de simular las condiciones in vivo en donde las mediciones se pueden realizar en intervalos fisiológicos de pH ± 0.05 a 37 °C ± 0.5. Además según la USP la velocidad típica de rotación puede estar entre 60 y 500 rpm, recomendándose 300 rpm para el disco rotatorio, en tal sentido, para el desarrollo del presente trabajo se consideró medios de disolución a pH 1.2, 4.5 y 6.8, una temperatura de 37 °C y una velocidad de 250 rpm. Es importante mencionar que los medios de disolución lo que tratan es de representar o simular los fluidos a los cuales será expuesto la arcilla dentro del tracto gastrointestinal y así poder evaluar la interacción la liberación del aluminio de la arcilla. En tal sentido, en el medio de disolución es importante el ajuste del pH, de modo tal que debe hallarse dentro de las 0.05 unidades de valor indicado en la monografía.33 En relación a los tiempos de muestreo realizados en el ensayo, para sus determinaciones, se consideraron periodos de estudio de formas farmacéuticas de liberación inmediata (30 y 60 minutos) y productos de disolución lenta (mayor a 60 minutos)33, 34.El periodo de ensayo in vitro fue de 90 minutos y los tiempos de muestreo fueron 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 minutos. Para la toma de alícuotas, esta se desarrolló en forma manual empleándose jeringas de vidrio de 5 mL conectadas a cánulas de acero inoxidable (muestreo con reposición). Cabe resaltar que cuando se desarrolló el estudio de disolución, se consideraron cuatro parámetros importantes como los son: la cantidad de arcilla, el tiempo, la temperatura y el pH. Finalmente como observaciones generales durante el desarrollo del ensayo se incluyeron: - Distribución regular de partículas por todo el vaso 42 - Movimiento errático o en giros de las paletas - Adherencia de las partículas a las paletas 4.1.1. Perfil de disolución a pH 1.2 Considerando que la fisiología gástrica constituye una compleja y dinámica interacción entre estructuras anatómicas, sus secreciones, el ambiente circundante y los factores exógenos aportados por el individuo. Es importante resaltar que la condición del estómago es principalmente ácida, lo cual para fines de estudio de disolución, se puede simular preparando ácido clorhídrico diluido (0.1N) como se indica en la farmacopea. Considerando lo anterior, se obtuvieron datos tras la disolución de diferentes cantidades de arcilla (50 mg, 250 mg y 500 mg) en solución ácida (pH 1.2 ± 0.05) (ANEXO 3) y se elaboró el figura 2 en donde se relaciona la cantidad de aluminio liberado (mg/L) en función del tiempo, se consideraron 13 puntos de muestreo en total. 3.5 50 mg 3.0 250 mg 500 mg 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 3. Aluminio liberado a pH 1.2 en función del tiempo y la cantidad de arcilla En general se observa que la cantidad de aluminio liberado es mayor conforme transcurre el tiempo, analizando la línea de tendencia de la liberación 43 Aluminio (mg/L) de aluminio de 250 mg y 500 mg de arcilla, se observa que la cantidad de aluminio liberado es constante los primeros 40 minutos y a partir de los 60 minutos la liberación es ligeramente mayor, sin embargo, la línea de tendencia correspondiente a 500 mg de arcilla evidencia una mayor liberación de aluminio durante todo el proceso en comparación con la cantidades de arcillas anteriores. Estudios sobre digestión y disolución de aluminosilicatos en medios ácidos (pH< 4), suponen que el aluminio en este medio, podría estar presente en forma de ion estable Al+3 el cual va incrementando en función del tiempo;65 comportamiento similar se observa en los resultados del Figura 3. Así mismo, en estudios relacionados a la toxicocinética del aluminio en materia de alimentación del lactante y vacunas, en donde se presentaron las propiedades farmacocinéticas y las toxicidades del punto final de aluminio, se postula que el aluminio y sus compuestos tienden a solubilizarse como cationes trivalente Al+3 en ambientes ácidos por debajo de pH 5, un fenómeno que hace que las superficies de aluminio exteriores sean inalterables de la lluvia ácida. De la misma manera, se menciona que compuestos de aluminio de la dieta se disocian en el ácido estomacal para convertirse en ligandos libres e iones de aluminio libres que posteriormente se hidratan para formar hexahidrato de aluminio trivalente.65 Por otro lado, Yakimova considera que el aluminio es uno de los elementos tóxicos más abundantes con la capacidad de contaminar el suelo, el agua y las cadenas tróficas.66 No obstante, las funciones biológicas específicas de aluminio para los animales y las plantas son desconocidos, por lo que no se considera como un nutriente esencial.67 En términos de actividad agronómica, la mayor parte de aluminio está limitado a las formas insolubles, tales como aluminosilicatos y / o precipitado como sulfato o hidróxido de aluminio.68 Sin embargo el aluminio se solubiliza a partir de silicatos y óxidos (formas no tóxicas) a Al3+ que es fitotóxico sólo bajo condiciones de bajo pH.69, 70 Numerosos estudios han informado que hay diversas formas de aluminio en suelos en forma de monómeros, polímeros o en fase sólida, y que su 44 concentración depende del grado y la duración de la hidrólisis de los compuestos de aluminio, además determinaron que existe una correlación significativa entre el pH bajo y una alta concentración de especies de aluminio fitotóxicos (Al+3). Con todo lo antes mencionado, se considera que el perfil de disolución de la arcilla a pH 1.2 ± 0.05, evidencia la liberación de aluminio bajo la forma iónica de Al+3. En el documento de referencia para el desarrollo de Guías para la calidad del agua potable de la OMS, se indica que el aluminio puede formar especies hidroxi-monoméricos, poliméricos, soluciones coloidales poliméricos, geles y precipitados, todos basados en iones positivos como Al+3 o aluminatos hidroxilados. Además, se mencionan que se pueden formar complejos con diversos compuestos orgánicos (ácidos húmicos o fúlvicos por ejemplo) y ligandos inorgánicos (por ejemplo, fluoruro, cloruro y sulfato), en donde la mayoría, pero no todos, son solubles. La química de aluminio en el agua es compleja, y muchos parámetros químicos, incluyendo el pH, determinan qué especies de aluminio están presentes en soluciones acuosas. En agua pura, el aluminio tiene una solubilidad mínima en el intervalo de pH 5,5 - 6,0; además, se indica que concentraciones de aluminio disuelto total incrementan a valores de pH altas o bajas.71 Además es importante mencionar que tras el análisis de los datos (correspondiente a 500 mg de arcilla) con el software OriginPro 9.0, la ecuación que describe la liberación de aluminio tiene las siguientes características Tabla 8. Características de la ecuación que describe la liberación de aluminio de 500 mg de arcilla a pH 1.2 Model Log2P2 Equation y = ln(a+b*x) Ecuación y= ln(2.961+ 0.019*x) Reduced Chi-Sqr 0.001 Adj. R-Square 0.956 Value Standard Error Al liberado a 2.961 0.050 b 0.019 0.001 45 Claramente se evidencia que la ecuación que describe la liberación de aluminio a pH 1.2 es de primer orden, esta ecuación nos permitirá predecir la liberación de aluminio en tiempos diferentes a los ensayados. 4.1.2. Perfil de disolución a pH 4.5 En el sistema digestivo, el duodeno es la parte del intestino delgado que conecta el estómago con el yeyuno. El duodeno está situado en la parte posterior y superior del abdomen, en el retroperitoneo, siendo la única porción del intestino delgado que se encuentra fijo, y está formado totalmente por músculo liso. El duodeno comienza en el píloro, la abertura de la parte inferior del estómago por la que vacía su contenido en el intestino y termina en la flexura duodeno-yeyunal, que lo separa del yeyuno.72 Considerando la fisiología del tubo gastrointestinal y las variaciones de pH a lo largo de tubo como se muestra en la figura 4, se consideró realizar las pruebas de disolución de la arcilla a pH 4.5 ± 0.05 a manera de simular el medio duodenal tal y como se realizan en los perfiles de disolución de medicamentos indicados en la farmacopea. Figura 4. Variaciones del pH a lo largo del tubo gastrointestinal73 46 Con los datos obtenidos tras la disolución de diferentes cantidades de arcilla (50 mg, 250 mg y 500 mg) en buffer acetato de sodio (pH 4.5 ± 0.05) (ANEXO 3) se elaboró el figura 5 en donde se relaciona la cantidad de aluminio liberado (mg/L) en función del tiempo (13 puntos de muestreo). Se evidencia una mayor desorción de aluminio cuando la cantidad de arcilla es mayor, además, cuando se trabaja con 250 mg y 500 mg de arcilla, la liberación de aluminio es constante en los primeros 15 minutos y a partir de los 30 minutos se evidencia un ligero incremento en dicha liberación. Por otro lado, la línea de tendencia de la liberación de aluminio cuando se ensaya con 500 mg de arcilla evidencia un incremento en la desorción de dicho metal a partir de los 5 minutos haciéndose constante luego de los 30 minutos en adelante. Realizando una comparación visual de las figuras 3 y 5, se evidencia una mayor liberación de aluminio a pH 4.5 ± 0.05. 3.5 50 mg 3.0 250 mg 500 mg 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 5. Aluminio liberado a pH 4.5 en función del tiempo y la cantidad de arcilla En un trabajo de investigación sobre el estudio experimental de la formación de complejos de acetato de aluminio, se realizaron pruebas de 47 Aluminio (mg/L)) solubilidad de bayerita y boehmita en función del pH y temperaturas de 60°C a 200°C, para determinar las estequiometrías y constantes de estabilidad de complejos de aluminio-acetato. El análisis de estos datos de solubilidad indican que los tres complejos de aluminio-acetato que se forman significativamente son: AlAcO+2, Al (OH)AcO+, y Al(AcO)+ 2. Los cálculos termodinámico indicados en el trabajo de investigación, demuestran que el acetato puede mejorar notablemente la solubilidad de dichos minerales que contienen aluminio a pH<5, pero tienen poco efecto en soluciones que tienen valores de pH más altos, el trabajo concluye resaltando en que la formación del complejo aluminio-acetato es muy importante en la solubilidad de los hidróxidos de aluminio a pH bajos (pH<5).74 Bajo las condiciones de trabajo en el que se desarrolló el perfil de disolución de la arcilla, se puede mencionar que la liberación del aluminio de la arcilla, se favorece por la formación de complejos de aluminio con el acetato, evidenciándose así la presencia de aluminio en el medio de disolución. Sin embargo, no se encontró información que pueda precisar cuál de las tres formas de complejos entre el aluminio y el acetato se ve favorecida al pH y la temperatura ensayada. Por otro lado, otras bibliografías indican que entorno a un pH 4.2, la movilización de Al+3 alcanza su máximo valor, debido a que el acetato se desprotona y se favorece la unión del aluminio a ella pudiéndose formar los complejos antes mencionados, además se menciona que el complejo AlAcO+ prevalece sobre el Al+3 e Al(OH)3 en un rango de pH de 1 – 3.5.74, 75 Es importante mencionar que tras analizar los datos con el software OriginPro 9.0, la ecuación que describe la liberación de aluminio tiene las siguientes características Cabe mencionar que la ecuación modelo Boltzman, se ajusta a los datos correspondientes a la liberación de aluminio cuando se ensayó con 500 mg de arcilla. 48 Tabla 9. Características de la ecuación que describe la liberación de aluminio de 500 mg de arcilla a pH 4.5 Model Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)/(1 + exp((x-x0)/dx)) Ecuación y=1.719+(1.033-1.719)/(1+exp((x-19.997)/ 0.030)) Reduced Chi-Sqr 0.001 Adj. R-Square 0.990 Value Standard Error A1 1.033 0.016 A2 1.719 0.012 Al liberado x0 19.997 438329.401 dx 0.030 4.97E+06 4.1.3. Perfil de disolución a pH 6.8 Centrándonos nuevamente en el figura 4, y continuando con los cambios de pH a lo largo del tracto digestivo, con la finalidad de simular las condiciones del yeyuno, se realizó el perfil de liberación del aluminio a pH 6.8 ± 0.05. Los parámetros de ensayo se consideraron según el proyecto de tesis. 3.5 50 mg 250 mg 3.0 500 mg 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 6. Aluminio liberado a pH 6.8 en función del tiempo y la cantidad de arcilla 49 Aluminio (mg/L) Los datos obtenidos tras la disolución de diferentes cantidades de arcilla (50 mg, 250 mg y 500 mg) en buffer fosfato pH 6.8 ± 0.05 se muestran en el ANEXO 3, además con esos mismos datos se elaboró el figura 6 en donde se relaciona la cantidad de aluminio liberado (mg/L) en función del tiempo (13 puntos de muestreo). La cantidad de aluminio liberado es mayor cuando la cantidad de arcilla puesta en disolución es mayor. En las tres líneas de tendencia se observa que la mayor cantidad de aluminio liberado se evidencia a partir de los 30 minutos haciéndose constante en adelante para el caso de 50 mg y 250 mg. Además, realizando una comparación visual de la liberación de aluminio en pH 1.2 ± 0.05; 4.5 ± 0.05 y 6.8 ± 0.05, se evidencia una mayor liberación a pH 6.8. Cabe mencionar que en el cuerpo humano, los fluidos extracelulares contienen aproximadamente 2 mmol de fosfato total por litro a pH 7,4 y el fluido intracelular tiene alrededor de 10 mmol de fosfato total por litro. A pH 6.6. El Al+3 forma una sal insoluble con fosfato, a menudo designado como AlPO4, o a veces como A1PO4. 2H20, que corresponde a la composición del mineral variscita. En 0,16 mol / L los valores de pKa para las sucesivas desprotonaciones de H3PO - -2 -3 -3 4  H2PO4  HPO4  PO4 son 2.0; 6.77 y 11.6. Así el PO4 es la especie dominante de fosfato a pH> 11.6, mientras que el Al+3 es la especie dominante a pH < 5.5. Por lo tanto cantidades significativas de ambos Al+3 y PO -3 4 son incompatibles en solución a cualquier pH. Si buscamos el complejo neutro global por la que existe compatibilidad, la especie H - 2PO4 es el dominante a un intervalo de pH de 2 - 6.8. Por otro lado el Al(OH)2 es la principal especie a pH 5.5 – 6; a efectos de la solución química, es ventajoso escribir AlPO4.2H2O como Al(OH) 76 2.H2PO4. En un trabajo de investigación titulado la química del aluminio y su relación con la biología y la medicina, se menciona que la distribución de las especies de aluminio en solución acuosa siguen las siguientes características: el hexahidrato octaédrico Al(H +3 2O)6 predomina a pH < 5, y el aluminio tetraédrico 50 como Al(OH) - 4 predomina a pH > 6.2, mientras que existe una mezcla de especies en un intervalo de pH de 5-6.476 El ion aquo Al+3 forma complejos de solución con aniones como el sulfato, fosfato y nitrato. Cuando la solubilidad de Al+3 es controlada por la gibbsita, todos los complejos excepto Al (NO3)3 pueden contribuir significativamente a total de aluminio en solución dependiendo de la actividad de los aniones. Por ejemplo, cuando la actividad de SO -2 4 es igual a 10-3.5, las actividades de AlSO + +3 4 y Al son iguales. Por otro lado, los complejos fosfato, y particularmente AlHPO + 4 , son significativos y cambia con la actividad del fosfato.77 Al analizar los datos con el programa OriginPro 9.0, la ecuación que describe la liberación de aluminio tiene las siguientes características Tabla 10. Características de la ecuación que describe la liberación de aluminio de 500 mg de arcilla a pH 6.8 Model Holliday1 Equation y = a/(a + b*x + c*x^2) Ecuación y= 1.232/(1.232 - 0.014*x+8.78E-05* x^2) Reduced Chi-Sqr 0.02278 Adj. R-Square 0.94084 Value Standard Error Al liberado a 1.232 0.066 b -0.014 0.001 c 8.78E-05 1.48E-05 La ecuación que describe la liberación de aluminio a pH 6.8, es el modelo Holliday 1 y es una ecuación de segundo orden con tres variables. Por otro lado es importante mencionar que durante el desarrollo del presente trabajo de investigación, además de determinar los perfiles de disolución del aluminio y cuyos resultados fueron mostrados, también se optó por determinar la liberación de dicho metal en otros dos medios como lo son el jugo gástrico simulado y el jugo intestinal simulado cuyas características se asemejan a los medios fisiológicos. 51 A nivel fisiológico, el jugo gástrico es una mezcla de secreciones de varias células epiteliales especializadas tanto superficiales como de las glándulas gástricas. Su composición química consiste en agua, ácido clorhídrico, trazas de cloruro de potasio, cloruro de sodio, bicarbonato, enzimas y mucus. Por otro lado, la principal enzima del jugo gástrico es la pepsina, si bien existen otras enzimas importantes para funciones específicas, sus cantidades son mucho menores. Además, es importante mencionar que la actividad catalítica de la pepsina es la de una endoproteasa, que rompe preferentemente los enlaces peptídicos que involucran aminoácidos aromáticos (p.ej. phe, try, tyr) y un aminoácido adyacente, generando productos de digestión fragmentados de muy diversos tamaños.78, 79 En tal sentido y como se especifica en la farmacopea, el jugo gástrico simulado fue preparado considerando como parte del medio la pepsina y ajustada a pH 1.4 ± 0.1. En relación al jugo intestinal, es una sustancia producida por la mucosa del intestino delgado, y con cuya acción culmina el proceso de degradación de nutrientes para pasar luego a ser absorbidos, en la farmacopea se indica que para preparar este jugo fisiológico, esta debe contener la enzima pancreatina y el pH debe ser ajustado a 7.5 ± 0.1. 4.1.4. Perfil de disolución en jugo gástrico simulado La liberación de aluminio en jugo gástrico simulado (ANEXO 3), sigue un comportamiento similar a las desarrolladas anteriormente en solución a pH 1.2. En el figura 7 se puede observar una mayor liberación del metal cuando se trabaja con 500 mg de arcilla y una menor liberación cuando con trata con 50 mg de arcilla. 52 50 mg 3.5 250 mg 500 mg 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 7. Aluminio liberado en jugo gástrico simulado en función del tiempo y la cantidad de arcilla La liberación de aluminio es exponencial hasta los 40 minutos y posteriormente se hace constante. Al realizar una comparación visual del perfil de liberación de aluminio a pH 1.2 y medio jugo gástrico simulado, se observa una mayor liberación de aluminio en el medio simulado, llegando a una concentración máxima de 1.938 ± 0.026 mg/L frente a una concentración de 1.533 ± 0.019 mg/L a pH 1.2. Además, es importante mencionar que la máxima cantidad de aluminio en medio jugo gástrico simulado se alcanzó a los 40 minutos, mientras que en solución a pH 1.2 la máxima cantidad de aluminio liberado fue a los 90 minutos. Considerando que ambos medios se encuentran a un pH ácido, es probable que la enzima pepsina presente solo en el jugo gástrico simulado, de alguna manera favorezca la mayor liberación del aluminio de la arcilla en un periodo de tiempo más corto. Algunas reportes indican la actividad farmacológica de ciertos antiácidos compuestos por sales de aluminio y magnesio, se unen a la pepsina, inactivando y reduciendo sus efectos dañinos contribuyendo así al control del reflujo gastroesofágico.80 Esta unión del 53 Aluminio (mg/L) aluminio a la pepsina podría explicar por qué se evidencia una mayor liberación de aluminio en un medio que contiene dicha enzima. Al analizar los datos con el programa OriginPro 9.0, la ecuación que describe la liberación de aluminio tiene las siguientes características. Tabla 11. Características de la ecuación que describe la liberación de aluminio de 500 mg de arcilla en jugo gástrico simulado Model DoseResp Equation y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-x)*p)) Ecuación y= 1.300+(1.921-1.300)/(1+10^((24.770-x)* 0.064)) Reduced Chi-Sqr 0.003 Adj. R-Square 0.958 Value Standard Error A1 1.300 0.058 Al liberado A2 1.921 0.025 LOGx0 24.770 2.126 p 0.064 0.020 4.1.5. Perfil de disolución en jugo intestinal simulado La liberación de aluminio en jugo intestinal simulado (ANEXO 3), sigue un comportamiento similar a la desarrollada en medio a pH 6.8. En el figura 8 se puede observar una mayor liberación de aluminio cuando se ensaya con 500 mg de arcilla, además la liberación del metal sigue un comportamiento exponencial durante los primeros 20 minutos, a partir del cual la liberación de hace constante. Realizando una comparación visual del perfil de liberación de aluminio a pH 6.8 y medio jugo intestinal simulado, se observa una mayor liberación de aluminio en el medio simulado, llegando a una concentración máxima de 3.057 ± 0.019 mg/L frente a una concentración de 2.867 ± 0.041 mg/L a pH 6.8. Además, es importante mencionar que la máxima cantidad de aluminio en medio jugo gástrico simulado se alcanzó a los 80 minutos, mientras que en solución a pH 6.8 la máxima cantidad de aluminio liberado fue a los 90 minutos. 54 50 mg 3.5 250 mg 500 mg 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 8. Aluminio liberado en jugo intestinal simulado en función del tiempo y la cantidad de arcilla Considerando que ambos medios se encuentran a un pH similar es probable que la enzima pancreatina, presente solo en el jugo intestinal simulado, de alguna manera favorezca la mayor liberación del aluminio de la arcilla en un periodo de tiempo relativamente menor. Analizando los datos con el programa OriginPro 9.0, la ecuación que describe la liberación de aluminio tiene las siguientes características. Tabla 12. Características de la ecuación que describe la liberación de aluminio de 500 mg de arcilla en jugo intestinal simulado Model DoseResp Equation y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-x)*p)) Ecuación Y=1.727+(2.9868-1.727)/(1+10^((15.695-x)* 0.170)) Reduced Chi-Sqr 0.00585 Adj. R-Square 0.9787 Value Standard Error A1 1.727 0.059 [Al] A2 2.968 0.028 LOGx0 15.695 0.658 p 0.170 0.040 55 Aluminio (mg/L) La ecuación que describe la liberación de aluminio en jugo intestinal simulado es de primer orden y está representada por cuatro variables. Como se ha podido analizar con anterioridad, la liberación de aluminio a partir de la arcilla en los diferentes medios de disolución, parecen seguir comportamientos similares, en tal sentido, a continuación se muestran figuras comparativos de la liberación de aluminio en los diferentes medios de disolución con la finalidad de establecer semejanzas o diferencias entre ellos teniendo como constante la cantidad de arcilla. 3.5 pH 1.2 pH 4.5 3.0 pH 6.8 J. Gástrico J. Intestinal 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 9. Aluminio liberado de 50 mg de arcilla en diferentes medios En el figura 9 se muestran las líneas de tendencia comparativas de la liberación de aluminio de 50 mg de arcilla en diferentes medios de disolución, en ella se evidencia que la liberación de aluminio es mayor cuando la arcilla es sometida en jugo intestinal simulado, solución a pH 6.8, solución a pH 4.5, jugo gástrico simulado y solución a pH 1.2 respectivamente. Es importante mencionar que la máxima cantidad de aluminio liberado en jugo intestinal simulado es de 56 Aluminio (mg/L) 1.279 mg/L de arcilla cuando se trabaja con 50 mg de arcilla total. Además, la liberación de aluminio en todos los casos se hace constante minutos antes de finalizar los 90 minutos. En el figura 10 se muestran las líneas de tendencia de la liberación del aluminio de 250 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución, se puede observar que la mayor cantidad de aluminio liberado se produce cuando la arcilla es colocada en jugo intestinal simulado, solución a pH 6.8, solución a pH 4.5, jugo gástrico simulado y solución a pH 1.2 respectivamente. pH 1.2 3.5 pH 4.5 pH 6.8 3.0 J. Gástrico J. Intestinal 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 10. Aluminio liberado de 250 mg de arcilla en diferentes medios La máxima cantidad de aluminio liberado en jugo intestinal simulado es de 2.286 mg/L de arcilla cuando se ensaya con 250 mg de arcilla total. La liberación de aluminio se hace constante minutos antes de finalizar los 90 minutos. En el figura 11 se muestran las líneas de tendencia de la liberación del aluminio de 500 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución, se puede observar que la mayor cantidad de aluminio liberado se produce cuando la arcilla 57 Aluminio (mg/L) es colocada en jugo intestinal simulado, solución a pH 6.8, jugo gástrico simulado, solución a pH 4.5 y solución a pH 1.2 respectivamente. La máxima cantidad de aluminio liberado en jugo intestinal simulado es de 3.057 mg/L de arcilla cuando se ensaya con 500 mg de arcilla total. Al igual que en el caso anterior, la liberación de aluminio se hace constante minutos antes de finalizar los 90 minutos. Es importante mencionar que la máxima liberación de aluminio durante todo el ensayo se produce a los 30 minutos, en medio jugo intestinal simulado y cuando se trabaja con 500 mg de arcilla. pH 1.2 pH 4.5 3.5 pH 6.8 J. Gástrico J. Intestinal 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 80 100 Tiempo (min) Figura 11. Aluminio liberado de 500 mg de arcilla en diferentes medios Con la finalidad de determinar si existe o no diferencia significativa en la cantidad de aluminio liberado de las diferentes cantidades de arcilla (50 mg, 250 mg y 500 mg), se realizó un análisis de varianza de las cantidades de aluminio liberado (mg/L) en los diferentes medios de disolución (pH 1.2, pH 4.5, pH 6.8, jugo gástrico simulado y jugo intestinal simulado). 58 Aluminio (mg/L) En la tabla 13 se muestra los resultados del análisis de varianza (ANOVA) de una vía realizada a las cantidades de aluminio liberado de 50 mg, 250 mg y 500 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución. Considerando los valores de probabilidad y los valores de F, se puede mencionar que existe diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) entre las cantidades de aluminio liberado en los diferentes medios de disolución a diferentes tiempos y los en las tres cantidades ensayadas. Tabla 13. Análisis de varianza de la cantidad de aluminio liberado en diferentes medios de disolución Tiemp F F F Valor Prob. Prob. Prob. o (50 mg) (250 mg) (500 mg) crítico (50 mg) (250 mg) (500 mg) (min) para F 3 8603.772 3202.608 788.285 1.241E-17 1.731E-15 1.890E-12 5 2050.156 1501.223 807.792 1.606E-14 7.611E-14 1.673E-12 10 7049.933 3588.524 662.451 3.358E-17 9.806E-16 4.493E-12 15 13870.774 2237.326 3721.978 1.140E-18 1.038E-14 8.171E-16 20 3859.364 3699.090 2760.646 6.818E-16 8.427E-16 3.635E-15 25 9957.541 6901.380 3273.931 5.977E-18 3.735E-17 1.551E-15 30 5634.888 10420.718 9507.802 3.478 1.029E-16 4.762E-18 7.530E-18 40 3328.412 2827.287 2307.879 1.428E-15 3.227E-15 8.893E-15 50 11165.696 5295.254 1267.568 3.372E-18 1.404E-16 1.770E-13 60 1948.754 2785.753 7869.411 2.069E-14 3.474E-15 1.938E-17 70 1485.403 3621.981 2313.096 8.024E-14 9.362E-16 8.793E-15 80 2655.839 1658.975 2532.786 4.410E-15 4.622E-14 5.589E-15 90 2572.098 2623.208 2297.828 5.176E-15 4.691E-15 9.089E-15 Para determinar entre que subgrupos de los analizados anteriormente se evidencia diferencias o semejanzas, se realizó la prueba post-hoc de Tukey HSD para cada caso en estudio, los resultados se detallan en los ANEXOS 4 Caracterización del modelo de disolución Para caracterizar el proceso de disolución se determinó la eficiencia de disolución o liberación (EF %), el tiempo medio de disolución (MDT) y la constante de disolución (Kd) de las máximas cantidades liberadas de aluminio en los 59 diferentes medios de disolución. Para determinar la eficiencia de liberación del aluminio, se trabajó con los datos que representan la máxima liberación de aluminio en los diferentes medios (500 mg de arcilla) ANEXO 5 La eficiencia de liberación porcentual, se calculó a partir de las curvas acumulativas de aluminio liberado mediante la ecuación siguiente.81 𝐴𝑈𝐶𝑇 0 𝐸𝐹(%) = 𝑥100 𝑄100𝑥𝑇 El tiempo medio de disolución se calculó a partir de las curvas acumulativas de la cantidad de aluminio liberado en función del tiempo mediante la siguiente ecuación. ∑[𝑡𝑖𝑥∆𝑄𝑖] 𝑀𝐷𝑇 = 𝑄∝ La constante de disolución se determinó con los logaritmos naturales de la cantidad de fármaco remanente en el lugar de disolución [ln(QT-Q)], en seguida se hace la regresión lineal de [ln(QT-Q)] frente al tiempo en donde la pendiente es la constante de disolución. Tabla 14. Eficiencia de liberación y tiempo medio de disolución del aluminio en los diferentes medios Medios EF% MDT (min.) K -1 d (min ) pH 1.2 76.18 21.44 0.014 pH 4.5 85.71 12.86 0.036 pH 6.8 89.08 8.80 0.012 J. Gástrico 87.96 8.74 0.031 J. Intestinal 89.21 8.01 0.107 La arcilla presenta mayor eficiencia de liberación de aluminio cuando se ensaya en medio Jugo intestinal simulado, pH 6.8, jugo gástrico simulado, pH 4.5 y pH 1.2 respectivamente. 60 En relación al tiempo medio de liberación de aluminio, se evidencia un mayor MDT cuando se ensaya en medio pH 1.2, pH 4.5, pH 6.8, jugo gástrico simulado y Jugo intestinal simulado respectivamente. 5. RESULTADOS DE ENSAYOS In vivo Tras los resultados obtenidos de las pruebas in vitro, es evidente la necesidad de desarrollar ensayos toxicológicos in vivo con la finalidad de determinar si existe la posibilidad de que el aluminio liberado por la arcilla pasa a circulación lo cual podría producir una intoxicación crónica en los consumidores, además es importante determinar la cantidad de aluminio que podría ser eliminado. El uso de animales en experimentación va en paralelo al desarrollo de la medicina, cuyas raíces provienen de la Grecia antigua. Según Baumans (2005) la creciente demanda de modelos animales de calidad, junto con las críticas vertidas sobre el modo en que se utilizan los animales, ha llevado a la aparición de una rama multidisciplinaria de la ciencia denominada ciencia de los animales de laboratorio, que se rige por los principios cardinales de las tres erres: reemplazo, reducción y refinamiento, formuladas por Russell y Burch en 1959.35-38 Figura 12. Extracción de sangre 61 Por otro lado, el uso de animales en la investigación, enseñanza y pruebas, es aceptable solamente si contribuye en forma efectiva a la mejor comprensión de principios biológicos fundamentales, o al desarrollo de conocimientos que, razonablemente, podemos esperar que beneficien a los seres humanos o a los animales.39 Considerando que el animal de laboratorio es “cualquier especie animal que se mantiene bajo condiciones determinadas y se utiliza con fines científicos”,82-84 para el desarrollo del presente trabajo de investigación, se utilizaron un total de 24 ratas machos albinas Wistar de la especie Rattus norvegicus provenientes del Bioterio de la Universidad Católica de Santa María. Los animales fueron ambientados 15 días antes del desarrollo del ensayo alimentándolos con maíz, trigo y agua ad libitum tal y como se indica en muchos trabajos de investigación desarrollados con este tipo de animales.85-87 Además, estos fueron albergados en jaulas individuales como se describió en el proyecto de investigación. Figura 13. Diseño de jaulas Así mismo, los pesos promedio de las ratas fueron de 225 ± 5 gramos (ANEXO 6) y el total de ellos fueron distribuidos al azar en tres grupos de trabajo los cuales fueron tratadas de la siguiente manera. 62 Tabla 15. Grupos de trabajo y tipos de tratamientos Grupo Tratamiento Control negativo 2 mL de agua ultra pura en ayunas Do 1 50 mg de arcilla por kg de peso en ayunas Do 2 500 mg de arcilla por kg de peso en ayunas Cabe señalar que durante el desarrollo de la investigación, se hizo todo lo posible por cumplir con las 3 R formuladas por Russell y Burch en 1959 en relación al uso de animales en laboratorio, además no se registraron problemas o decesos en los animales durante el periodo experimental. 5.1. Resultados de ensayo in vivo en muestras de sangre No hay evidencias que indiquen que el aluminio cumpla una función esencial en animales o humanos y no se ha podido identificar ningún síntoma asociado a la deficiencia de aluminio. Sin embargo algunos trabajos en animales indicarían una posible función biológica que necesita ser estudiada más a fondo. Es interesante notar que, debido a su abundancia en la naturaleza, es difícil diseñar experimentos donde no haya contaminaciones con trazas de aluminio. Por esta razón es difícil identificar síntomas asociados con una deficiencia en aluminio. La mayor parte de los compuestos de aluminio son sumamente estables y muy pocas de las formas que se encuentran en la naturaleza son asimilables por el organismo. Consistentemente con estas características, los problemas asociados con la exposición al aluminio se han incrementado sustancialmente desde principios del siglo XX y se los considera consecuencia de que en este período ha crecido rápidamente la actividad de las industrias que usan compuestos de aluminio de mayor biodisponibilidad. De las tres vías por las que una sustancia puede entrar al organismo (oral, dérmico y respiratorio) las características químicas de los compuestos de aluminio hacen que la vía dérmica sea la menos importante. La principal población de riesgo 63 para la exposición por vía respiratoria está formada por los trabajadores de fundiciones de aluminio y otras industrias relacionadas. El aluminio contenido en el aire de estos ambientes de trabajo usualmente está en forma de partícula e ingresa por los pulmones donde tiende a acumularse.88 Además, se considera que la principal vía de exposición al aluminio para la población general es la oral (alimentos y algunos medicamentos). El aluminio que ingresa por esta vía se absorbe a nivel intestinal. Si bien aún no han sido totalmente aclarados los mecanismos de esta absorción se sabe que el proceso es fuertemente dependiente de la forma química en la que se lo encuentra y de la presencia de sustancias capaces de complejarlo (por ejemplo el citrato) que, al formar estructuras solubles aumentan la absorción del metal a nivel celular.65, 88, 89 Considerando las principales vías de ingreso del aluminio, es que tras la administración de las dos dosis de la arcilla vía oral (ayunas), las muestras de sangre fueron extraídas del plexo venoso retro-orbital durante un periodo de 24 horas extendidas en: 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 y 24 horas; posteriormente las muestras fueron digeridas y analizadas por triplicado en el ICP-OES. Figura14. Muestras de sangre En el ANEXO 7 se muestran resultados promedio de las concentraciones de aluminio en sangre y en el figura 15 se muestran las líneas de tendencia comparativas de dichos resultados. 64 Tabla 16. Anova del control negativo de muestras sanguíneas F Valor crítico para Probabilidad F 0.466 2.017 0.893 En la tabla 16 se muestran datos del control negativo al cual se les realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía determinándose que no existía diferencia estadísticamente significativa (p>0.05) en las concentraciones de aluminio a los diez tiempos ensayados, lo cual indica que no hay evidencia de variabilidad de los datos producida por factores internos y/o externos durante el periodo experimental. Control negativo 25 Do 1 Do 2 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tiempo (h) Figura 15. Aluminio en sangre de los tres grupos de estudio En el figura 15 se observa las tres líneas de tendencia correspondientes de los tres grupos de trabajo. En el grupo control negativo se evidencia que las concentraciones 65 Aluminio (ppm) de aluminio no varían conforme pasa el tiempo, lo cual es un indicativo de que no hubieron influencias internas y/o externas que afectaron el desarrollo del ensayo. En relación a las líneas de tendencia correspondiente a los tratamientos Do1 y Do2, se observan un incremento exponencial de la concentración de aluminio en las primeras 6 horas, a partir de las 8 horas, se evidencia el decaimiento de ambas líneas de tendencia lo cual indica que la concentración de aluminio en sangre disminuye en función del tiempo. Además, se observa que a mayor dosis de arcilla administrada, mayor es la cantidad de aluminio liberado y por ende mayor es la cantidad detectada en sangre. Así mismo, después de 24 horas de administrada la arcilla, las cantidades de aluminio decrecen. Hasta hace poco tiempo se consideraba al aluminio como un elemento inerte con relación al hombre. En la actualidad no se le atribuye ninguna función positiva en la fisiología humana. A pesar de la abundancia y ubicuidad de este elemento en el ambiente se encuentra en concentraciones muy pequeñas en diversos tejidos del organismo, lo que demuestra la existencia de barreras fisiológicas de protección a sus efectos.90 Es importante mencionar que en el presente trabajo de investigación, la administración de la arcilla a los animales de experimentación fue vía oral y en ayunas, dado que, se ha supuesto que la presencia de alimentos en el estómago inhibe la absorción de aluminio, debido a la asociación de aluminio con ligandos orgánicos presentes en los alimentos. Sólo unos pocos estudios han apoyado directamente esta hipótesis.89 Por otro lado, Walton y colaboradores llevaron a cabo un ambicioso estudio para evaluar los efectos de bebidas y alimentos en la absorción de aluminio por vía oral. Sus resultados muestran un aumento de la concentración sérica máxima de aluminio y la excreción urinaria de aluminio tras la coadministración con zumo de naranja, y en menor medida, el café y el vino. Por otro lado, se menciona que la carne y productos a base de carbohidratos y cereales podrían disminuir la absorción de aluminio89, 91. En relación a la influencia de factores biológicos en la absorción de aluminio administrado vía oral, algunas investigaciones sugieren que la uremia parece 66 aumentar la absorción del aluminio mediante el aumento de la permeabilidad del intestino de la vía paracelular.92 El argumento de que la absorción de aluminio se ve reforzada en el estado urémico se apoya en el trabajo de investigación relacionada a la absorción gastrointestinal de aluminio en ratas urémicas, en donde para investigar la posibilidad de mejorar la absorción gastrointestinal de aluminio en estado urémico, se midió la excreción urinaria de aluminio de ratas después de una carga oral de 11 mg y 15 mg de aluminio vía endovenosa, se determinó que las ratas urémicas excretan significativamente menos aluminio durante las primeras 24 horas por lo que se asume que la absorción gastrointestinal de aluminio se aumenta en ratas urémicas.93 Aunque los alimentos comprenden la fuente primaria de aluminio para el ser humano, existen muy pocos datos sobre la biodisponibilidad oral de aluminio de alimentos o bebidas que no sean agua. Por otro lado, es probable que tras un consumo crónica de la arcilla, la acumulación de aluminio pueda efectuarse, debido no solo a la excreción disminuida o a la absorción aumentada del intestinal, sino también al solo hecho de consumir en forma continua productos que contienen dicho metal como es la arcilla. En tal sentido es importante mencionar que la exposición a altos niveles de aluminio, puede causar serios problemas para la salud.94, 95 es así que existen numerosos estudios que han examinado el potencial del aluminio para inducir efectos tóxicos en los seres humanos expuestos a través de la inhalación, exposición cutánea o vía oral. La mayoría de estos hallazgos están respaldados por un gran número de estudios en animales de laboratorio y estudios de exposición en el trabajo. Los estudios en animales sugieren que los pulmones y el sistema nervioso pueden ser los objetivos más sensibles de toxicidad tras la exposición por inhalación.96 Hay una extensa base de datos sobre la toxicidad oral de aluminio en animales. Estos estudios identifican claramente al sistema nervioso como el objetivo más sensible de la toxicidad del aluminio y la mayoría de los estudios en animales se han centrado en la neurotoxicidad y la toxicidad del desarrollo neurológico. Otros efectos adversos que han sido observados en los animales expuestos a aluminio por 67 vía oral incluyen eritropoyesis deteriorada en ratas expuestas a 230 mg de aluminio/kg/día, el daño de los eritrocitos se evidencia por la disminución de la hemoglobina, el hematocrito, eritrocitos con fragilidad osmótica, y eritrocitos alterados morfológicamente. Además, se reporta retrasos en la maduración de las crías tras la exposición de ratas a 53 mg de aluminio/kg/día, y la disminución de la ganancia de peso corporal de las crías de ratas y ratones expuestos a 103 mg de aluminio/kg/día.96 Por otro lado, la enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo, que se manifiesta clínicamente como un deterioro progresivo de la memoria y la cognición. Las características neuropatológicas primarios de la enfermedad de Alzheimer son la pérdida neuronal y la formación de ovillos neurofibrilares, placas seniles con depósitos de amiloide y los hilos del neuropilo, y la deposición amiloide cerebrovascular.97 La etiología de la enfermedad de Alzheimer es compleja, con la genética juegan un papel crítico; también hay pruebas de que el medio ambiente puede modificar el riesgo. La posible asociación entre el aluminio y la enfermedad de Alzheimer se propuso hace más de 40 años; un gran número de estudios evidencian la relación entre el aluminio y la enfermedad de Alzheimer.97 Estos estudios incluyen elevados niveles de aluminio en el cerebro de las personas con enfermedad de Alzheimer. Tabla 17. Anova de muestras sanguíneas de los tres grupos de ensayo Tiempo F Valor crítico Probabilidad (h) para F 0 0.059 0.942 1 4771.827 1.220E-28 2 2006.007 1.057E-24 4 1642.824 8.506E-24 6 2380.148 1.770E-25 8 1722.771 3.467 5.181E-24 10 3309.195 5.636E-27 14 3166.846 8.929E-27 18 3940.686 9.054E-28 24 2855.705 2.635E-26 68 Es importante mencionar que ciertos estudios indican que los metales desempeñan un papel catalizador importante en la producción de radicales libre, y la atención se ha centrado en el papel de muchos metales en la enfermedad de Alzheimer, incluyendo hierro, aluminio, mercurio, cobre y zinc.98, 99 Además, se realizó el análisis de varianza a todos los datos de los tres grupos de experimentación (tabla 17). Los valores de F indican que no existe diferencia estadísticamente significativa (p>0.05) en las concentraciones de aluminio en el tiempo 0 (basal) entre los tres grupos de ensayo, sin embargo se evidencian diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en las concentraciones de aluminio en el resto de tiempos de ensayo entre los tres grupos. Para determinar entre que subgrupos de los analizados anteriormente se evidencia diferencias o semejanzas, se realizó la prueba post-hoc de Tukey HSD para cada caso en estudio, los resultados se detallan en los ANEXOS 8 Analizando los datos en el programa OriginPro 9.0, la ecuación que describe la absorción de aluminio tiene las siguientes características (tabla 18). La ecuación que describe la cantidad de aluminio que pasa a la sangre por unidad de tiempo, corresponde a una ecuación de primer orden. Tabla 18. Características de la ecuación que describe la absorción de aluminio en animales de experimentación Model Nelder Equation y = ( x + a )/( b0 + b1*(x+a) + b2*(x+a)^2 ) Ecuación y = ( x + 0.009 )/( 0.079 + 0.014*(x+0.009) + 0.003* (x+0.009)^2 ) Reduced Chi-Sqr 1.013 Adj. R-Square 0.978 Value Standard Error a 0.009 0.078 [Al] b0 0.079 0.012 b1 0.014 0.004 b2 0.003 3.41E-04 69 5.2. Resultados de ensayos in vivo en muestras de orina El aluminio, una vez absorbido, se distribuye en la mayoría de los órganos dentro del cuerpo, con la acumulación que se produce principalmente en el hueso a dosis altas. En un grado limitado, pero aún no determinado, el aluminio pasa a la sangre - barrera del cerebro y también se distribuye en el feto. El aluminio se elimina de manera efectiva en la orina (OMS, 1997). Considerando la toxicocinética del aluminio y sus principales vías de eliminación (orina)71, se tomaron muestras de orina a las 24, 48, 72 y 96 horas. Las muestras fueron diluidas en HNO3 al 3 % y posteriormente analizadas por triplicado en ICP-OES. En el ANEXO 9 se muestran resultados promedio de las concentraciones de aluminio en orina con los cuales se realizó la figura 16, en donde se observan tres líneas de tendencia correspondientes a los tres grupos de trabajo. En el grupo control negativo se observa que las concentraciones de aluminio en muestras de orina no varían conforme transcurre el tiempo, lo cual es un indicativo de que no hubieron influencias internas y/o externas que afectaron el desarrollo del ensayo. 25 Control negativo Do 1 20 Do 2 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tiempo (h) Figura 16. Aluminio en orina de los tres grupos de estudio 70 Aluminio (ppm) En relación a las líneas de tendencia correspondiente a los tratamientos Do1 y Do2, se observa un incremento exponencial de la concentración de aluminio a las 48 horas, posteriormente se observa el decaimiento de ambas líneas de tendencia lo cual indica que la eliminación del aluminio por orina disminuye en función del tiempo. Además, se observa que a mayor dosis de arcilla administrada, mayor es la cantidad de aluminio excretado vía urinaria. Es importante mencionar que las concentraciones finales de aluminio de los tratamiento Do1 y Do2 a las 96 horas, no logran alcanzar concentraciones similares a las del grupo control, esto indica que la totalidad del aluminio no fue eliminado por lo que podría existir la acumulación de una parte de este metal en los órganos blancos. Considerando que la principal vía de excreción del aluminio es la vía renal, la función renal reducida aumenta el riesgo de acumulación del aluminio lo cual podría conllevar a una toxicidad en el ser humano.89 En algunos estudios se ha observado un aumento de la acumulación progresiva de los metales en la orina y tejidos de ratas en el siguiente orden: riñón, hígado, corazón y cerebro.11 por otro lado, se estima que el riñón es capaz de eliminar hasta 500 μg de aluminio (18 μmol) por día.90 Algunos datos adicionales relacionados a la excreción del aluminio vía renal se detallan más adelante. Para determinar la variabilidad de las concentraciones de aluminio en las muestras de orina del control negativo durante el periodo experimental, se realizó un análisis de varianza en donde no se reportó diferencias estadísticamente significativas (p>0.05) de dichas concentraciones durante el periodo experimental. Por lo que se puede afirmar que no hubo influencias externas y/o internas que pudieron afectar los datos. Tabla 19. Anova del control negativo de muestras de orina F Valor crítico para F Probabilidad 0.200 2.947 0.895 71 Además, se realizó el análisis de varianza de los datos urinarios de los tres grupos de experimentación (tabla 20). Los valores de F evidencian diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) en las concentraciones de aluminio en orina entres los tres grupos de ensayo como se observa en el figura 16. Tabla 20. Anova de muestras urinarias de los tres grupos de ensayo Tiempo F Valor crítico Probabilidad (h) para F 24 5553.203 2.490E-29 48 4473.135 3.467 2.401E-28 72 2876.575 2.442E-26 96 2002.443 1.077E-24 Para determinar entre que subgrupos de los analizados anteriormente se evidencian diferencias o semejanzas, se realizó la prueba post-hoc de Tukey HSD para cada caso en estudio, los resultados se detallan en los ANEXOS 10 6. TOXICOCINÉTICA DEL ALUMINIO Entendiéndose por toxicocinética el estudio cuantitativo de los procesos que experimenta un xenobiótico, en función del tiempo, en un organismo vivo, es que en forma general los xenobióticos, y en este caso el aluminio, sufren un conjunto de procesos una vez ingeridos. Dentro de este conjunto de acciones se encuentran la absorción, distribución, metabolismo y excreción, cuyos datos una vez adquiridos, son susceptibles de un tratamiento cinético o evaluación matemática con relación al tiempo.73 Como parte del estudio de la absorción del aluminio proveniente de la arcilla, con los datos obtenidos del ensayo in vivo, se determinaron algunos parámetros de biodisponibilidad como concentración máxima (Cmax), tiempo máximo (Tmax) y área bajo la curva (AUC), en donde se evidencia una relación directamente proporcional entre la cantidad de arcilla administrada y el incremento de los parámetros de absorción. Además de determinaron parámetros toxicocinéticos como la constante 72 de absorción (Kabs,), tiempo medio de absorción (T1/2 abs ), constante de eliminación (Ke) y tiempo medio de eliminación (T1/2e). Tabla 21. Parámetros de biodisponibilidad y toxicocinéticos del aluminio. Do 1 (50mg/kg) Do 2 (500mg/kg) Cmax (mg/L) 18.644 ± 0.876 21.406 ± 0.968 Tmax (h) 6 6 AUC (mg.h/L) 466.856 708.663 Kabs 0.051 0.568 T1/2 abs 13.555 1.220 Ke 0.501 0.040 T1/2e 1.383 17.493 En relación a la absorción, esta se define como su entrada en el torrente circulatorio, lo que es diferente de ingestión o inhalación. Recordemos que las membranas celulares, al estar constituida por una elevaba porción de lípidos, significan una gran barrera para el agua y los productos hidrosolubles. Por el contrario, las sustancias liposolubles se difunden a través de la membrana con tanta mayor facilidad cuanto mayor es su coeficiente de partición lípido-agua, dentro de unos límites.73 En relación al aluminio, una pequeña fracción de este se convierte en sistémica a través de procesos que aún no se han dilucidado, pero se cree que involucran mecanismos paracelulares pasiva o difusión transcelular. Por otro lado, se cree que un mecanismo mediado por ácido carboxílico mejora la absorción en el tracto gastrointestinal del aluminio. En algunos trabajos llevados a cabo en animales de experimentación, refieren la siguiente absorción relativa de compuestos de aluminio en ratas: citrato > lactato > sulfato de sacarosa > cloruro > hidróxido > glicinato > borato.100 Otras publicaciones mencionan que cationes de aluminio trivalentes pueden bloquear la absorción de fósforo trivalente bioesencial o aniones fosfato.101, 102 La absorción gastrointestinal de aluminio también puede estar influida, entre otros factores, por el metabolismo del hierro. Ambos elementos parecen compartir 73 una serie de propiedades comunes tales como la utilización conjunta de la transferrina como proteína transportadora plasmática, los depósitos conjuntos de hierro y aluminio en los lisosomas de la médula ósea y la afinidad similar por determinados quelantes.94, 103 Es importante mencionar que el pH puede influir mucho en la especiación de aluminio, y, presumiblemente en la biodisponibilidad de este tal y como se evidenció en los resultados hallados en los ensayos in vitro. Cabe resaltar que la capacidad de citrato para incrementar la biodisponibilidad oral de aluminio ha recibido mucha atención. Greger y colaboradores,71, 92, 104 han propuesto tres mecanismos principales: a) el citrato mejora la solubilidad del aluminio en el intestino, b) el citrato transporta el aluminio dentro de las células de la mucosa y c) el citrato apertura las uniones estrechas epiteliales. Por otro lado, según las investigaciones de Taylor y colaboradores los diferentes tiempos de picos de aluminio sérica máxima y citrato después del consumo de citrato de aluminio sugieren que el aluminio no se libera en la sangre como citrato de aluminio.105 Otros estudios llevados a cabo sugieren que el aumento de la absorción de aluminio después de la administración de aluminio citrato se produce en el intestino proximal a través de la ruta paracelular, debido a la apertura de las uniones estrechas celulares.106 Finalmente, se postula que cuando los cationes de aluminio se encuentran con las secreciones alcalinas tamponadas del intestino, este precipita como hidróxidofosfato de aluminio y no está disponible para su absorción. sin embargo, el citrato y la disponibilidad de otros aniones orgánicos (ascorbato, gluconato, lactato, malato, oxalato y tartrato) pueden formar complejos con el aluminio para formar compuestos que son solubles a pH alcalino y por lo tanto disponible para su absorción.107 En relación a la distribución del aluminio, se estima que el aluminio sistémico se une a las proteínas séricas o aniones y se distribuye rápidamente a otros tejidos en todo el cuerpo. Aproximadamente, 89% del aluminio de llegar a la sangre se une con la transferrina, y el resto se une principalmente al citrato.99, 108 Una vez que el 74 aluminio se encuentra en el torrente sanguíneo, se distribuye ampliamente a los diversos tejidos del cuerpo en un patrón que pueden ser paralelas a la densidad de la transferrina de receptores dentro de los tejidos. En un trabajo de investigación en donde el hidróxido de aluminio inyectado por vía intramuscular en conejos, se halló el siguiente patrón de redistribución en tejido: riñón > bazo > hígado > corazón > linfático > cerebro.109, 110 Además, el modelo en ratas sigue el mismo patrón, y la adición de análisis de aluminio en huesos mostraron que la deposición ósea es muy superior a la de los riñones, con un valor que se duplicó en ratas urémicas.111 Sobre la base de estos los estudios, se afirma que el hueso es el principal reservorio a largo plazo del aluminio sistémico ya sea después de la ingestión o inyección en humanos.102 Finalmente, en relación a la distribución de aluminio, se ha evidenciado que en pacientes con niveles bajos de hierro y ferritina elevada, se produce un incremento de la unión del aluminio a la transferrina, lo que resulta en un incremento de la cantidad total de aluminio a pesar de niveles plasmáticos normales o poco elevados. De esa forma el aluminio puede dar lugar a problemas en la utilización de hierro o interferir en la biodisponibilidad de las reservas de hierro para la eritropoyesis. Secundariamente, eso puede inducir aumento de las resistencias a EPO.95 En relación a la excreción del aluminio se puede mencionar que la retención de este metal se ve directamente afectado por la excreción, tanto en ratas como en seres humanos. En ese sentido, Xu y colaboradores determinaron que el 66-70% de aluminio inyectado se excreta en 24 horas.112 Por otro lado, es importante resaltar que la observación a largo plazo de las concentraciones de aluminio en excretas y el cuerpo, reveló excreciones de aluminio > 50% durante las primeras 24 horas, 85% a los 13 días, y el 96% en 1178 días posteriores. Además, se sugiere que la eliminación del aluminio sigue una función de potencia que ofrece una liberación inicial rápida seguida de componentes sucesivamente a más largo plazo. El resultado podría sugerir una acumulación lenta global de aluminio en el cuerpo durante toda la vida.102 75 Estas referencias sobre la excreción del aluminio vía renal, confirman nuestros hallazgos, ya que como se observa en la figura 16 la concentración de aluminio en la orina a las 24 horas, cuando se ensaya con la Do 1, es de 8.351 ± 0.298 mg/L, el cual comparada con la máxima concentración de aluminio en sangre de este mismo grupos, representa el 44.79%, este valor representa el porcentaje de aluminio excretado vía urinaria en las primeras 24 horas en el grupo Do 1. En relación al grupo Do 2, la máxima concentración de aluminio excretado vía renal es de 11.257 ± 0.358 mg/L que representa un porcentaje de eliminación del 52.59% en las primeras 24 horas. Además, como parte del análisis de excreción de aluminio por la orina, en el presente trabajo de investigación, se determinó los volúmenes urinarios (ANEXO 11) y se determinó el clearance renal para cada grupo de estudio. 2.00 Control negativo 1.80 Do 1 1.60 Do 2 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tiempo (horas) Figura 18. Volumen urinario En el figura 18 se evidencia que el volumen urinario (mL) es mayor en el grupo de ratas que fueron tratadas con la Do 2 seguida del grupo de Do1. Además se evidencia que el volumen urinario decrece paulatinamente en función del tiempo. Como parámetros cinéticos de excreción de aluminio se determinó el clearance renal con la siguiente ecuación.73 76 mL 𝑈 𝑥 𝑉 𝐶𝐿 = 𝑃 Dónde: U = Concentración de aluminio en orina V = volumen urinario por minuto P = concentración plasmática de aluminio Considerando las máximas concentraciones de aluminio hallados en muestras de sangre y orina, se determinó que el clearance renal para el control negativo, Do 1 y Do 2 fue de 0.278 mL/min, 0.407 ml/min y 1.181 mL/min respectivamente. Por lo que es evidente una mayor depuración o funcionamiento renal cuando se ensaya con mayores cantidades de arcilla o como es lo mismo, cuando existe mayor concentración de aluminio en circulación sanguínea. Por otro lado, es importante mencionar que algunos reportes indican que el riesgo de intoxicación por aluminio aumenta fuertemente si hay una disfunción renal.65, 89 Por otro lado, se determinó la cantidad de aluminio excretado por orina cuyos valores numéricos estas en el ANEXO 12 y se muestran en la figura 19. 8.00 Control negativo 7.00 Do1 6.00 Do2 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tiempo (h) Figura 19. Cantidad excretada de aluminio 77 Aluminio excretado (µg) Considerando que la principal vía de exposición al aluminio para la población general es la oral. El aluminio que ingresa por esta vía se absorbe a nivel intestinal. Si bien aún no han sido totalmente aclarados los mecanismos de esta absorción se sabe que el proceso es fuertemente dependiente de la forma química en la que se lo encuentra y de la presencia de sustancias capaces de complejarlo (citrato) que, al formar estructuras solubles aumentan la absorción del metal a nivel celular. Algunos autores mencionan que menos del 1 % del aluminio ingerido es absorbido en el intestino y pasa a circulación constituyendo este órgano la primera barrera protectora.71 Además, se indica que, la mayor parte del aluminio absorbido por el tracto intestinal es excretado por orina (segunda barrera protectora).88 En individuos con riñones funcionalmente normales un incremento en la ingesta de aluminio (por ejemplo por consumir algunos antiácidos) genera un aumento tanto en la absorción intestinal como en la excreción urinaria manteniéndose relativamente estables los niveles plasmáticos (no se conocen bien los mecanismos que permiten esta regulación). En cambio un porcentaje importante del aluminio que ingresa por vía respiratoria (usualmente en forma particulada) permanece en los pulmones. Como ya se mencionó la principal población de riesgo de intoxicación por aluminio está formada por los pacientes con disfunción renal. Según la OMS el elevado valor de la DL50 del aluminio (500mg/kg) indica que su toxicidad aguda es baja. La cantidad de aluminio que debería ingerir una persona sana en una sola dosis para intoxicarse gravemente es muy alta y es muy difícil lograrla. Y esto se refleja en los datos epidemiológicos: si bien en ciertos casos algunos compuestos de aluminio pueden causar dermatitis por contacto, la intoxicación aguda asociada con aluminio es sumamente rara.88 Sin embargo, la principal preocupación respecto a los efectos que la exposición al aluminio puede tener sobre la salud de la población en general, se centra en los casos en los que el ingreso al organismo es excesivo. Estos casos están circunscriptos a las personas que ingieren en forma habitual grandes cantidades de compuestos de aluminio (consumo regular de antiácidos o hábitos geofágicos que puede resultar en una acumulación), en un periodo relativamente corto o pequeñas 78 cantidades de compuestos de aluminio en un periodo de tiempo largo por lo que es posible que se produzca una intoxicación crónica.44, 53, 88 Entre otros datos, no se han encontrado evidencias que indiquen que el aluminio sea cancerígeno o mutagénico. Sin embargo algunos estudios realizados con animales han demostrado que tiene propiedades embriotóxicas. Los efectos dependen de las dosis, de la vía de administración y del estadío de desarrollo del embrión al momento de la exposición. Sin embargo es importante tener en cuenta que no se han observado efectos nocivos sobre el feto con mujeres que consumieron durante el embarazo antiácido conteniendo aluminio.88 Por otro lado, los datos publicados sobre la biodisponibilidad oral de especies de aluminio presentes en las drogas incluyen hidróxido de aluminio; el antiácido sucralfato; lactato de aluminio, que se utiliza en los productos dentales para dientes sensibles; y de aluminio en presencia de citrato, muestran que los antiácidos/quelantes de fosfato tienen el potencial de producir un mayor incremento de absorción de aluminio de todas las fuentes. Esto presenta un problema cuando estos productos, que por lo general contienen hidróxido de aluminio, se consumen en grandes cantidades por personas cuya función renal está deteriorado.89 Tabla 22. Concentraciones de aluminio en ensayos in vivo – in vitro. Datos in vivo Datos in vitro Tiempo [Al] Tiempo [Al] f’(X) minutos mg/L minutos mg/L dx/dt 0 0.41 3 1.663 0.003 60 9.194 5 1.789 0.007 120 18.481 10 1.900 0.043 240 20.869 15 2.215 0.119 360 21.406 20 2.849 0.064 480 20.869 25 2.822 0.012 600 18.906 30 3.019 0.002 840 15.788 40 2.905 4.00E-05 1080 14.081 50 2.926 7.204E-7 1440 10.488 60 2.984 1.440E-8 70 2.926 2.879E-10 80 3.057 5.757E-12 90 3.022 1.151E-13 79 Es importante mencionar que los aspectos toxicológicos asociados al consumo de aluminio contenido en los alimentos son menos claros. No hay suficiente información como para establecer una dosis máxima recomendable para la ingesta de aluminio presentes en alimentos. Finalmente, y como parte del análisis global de los resultados, se realizó una análisis de correlación in vivo in vitro (IVIVC) con los datos que representan la mayor liberación de aluminio tanto in vitro (medio jugo intestinal simulado) como in vivo (Do2: 500mg/kg). En ambos casos y con fines comparativos, se uniformizaron unidades y se halló la primera derivada de los datos in vitro. De los tres niveles de correlación existentes, se decidió utilizar el nivel A por representar una relación punto a puno entre la disolución “in vitro” y la velocidad de absorción “in vivo”. En tal sentido, la comparación IVIVC se realizó considerando los siguientes aspectos. - Analizando el grado de superposición de las curvas - Determinando la descripción matemática para ambas curvas [Al] 20 10 0 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Tiempo (min) Figura 20. Concentraciones de aluminio in vitro 80 [Al] (mg/L) La ecuación matemática que describe los datos in vivo de liberación de aluminio es el modelo Rational-Nelder (R=0.978), cuyas valores y características se describen a continuación. (𝑥 + 0.535) 𝑦 = (4.702 + 0.014 ∗ (𝑥 + 0.535) + 5.12𝐸 − 5 ∗ (𝑥 + 0.535)2) f'(x) 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0 50 100 Tiempo (min) Figura 21. Primera derivada de las concentraciones de aluminio in vitro La ecuación matemática que describe la primera derivada f’(x) de los datos in vitro de la liberación de aluminio es el modelo GaussAmp (R=0.997), cuyas valores y características se describen a continuación. 𝑥 − 15.637 2 𝑦 = 0.001 + 0.119 ∗ exp [−0.5 ∗ ( ) ] 3.950 81 f'(x) Tras analizar el grado de superposición de las curvas (figura 22), es evidente que no existe una IVIVC de nuestros datos. 22 0.14 in vivo 20 in vitro 0.12 18 16 0.1 14 12 0.08 10 0.06 8 6 0.04 4 0.02 2 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Tiempo (min) Figura 22. Superposición de curvas in vivo e in vitro Por otro lado, analizando las ecuaciones que describen los procesos in vivo e in vitro, se tratan de ecuaciones totalmente distintas por lo que es evidente que no existe una IVIVC. 82 [Al] mg/L f'(x) CONCLUSIONES 1) El “chaco” es una arcilla comestible cuyo pH en agua neutra es de 6.5, además el análisis de la arcilla en ICP-OES, determinó que la composición química es multielemental incluyendo micro-elementos como el selenio, cobre, hierro, cromo y zinc, hasta elementos considerados tóxicos para la salud como el plomo, cadmio, titanio, aluminio, etc. 2) El método de ICP-OES para la determinación de aluminio es exacto, preciso y sensible. 3) Los resultados in vitro evidencian que se produce una mayor liberación de aluminio cuando se ensaya con una mayor cantidad de arcilla (500m g), además la cantidad de aluminio disuelto in vitro, depende del tipo de medio de disolución observándose así, una mayor liberación de aluminio en jugo intestinal simulado a pH 7.2. 4) Los resultados in vivo determinan que la administración de Do1 (50mg/kg) y Do2 (500 mg/kg), producen un incremento exponencial de la concentración de aluminio en las primeras 6 horas alcanzando concentraciones máximas de 18.644 ± 0.976 y 21.406 ± 0.968 mg/L respectivamente. En relación a las muestras de orina, la concentración de aluminio a las 24 horas, cuando se ensaya con la Do 1, es de 8.351 ± 0.298 mg/L, el cual representa el 44.79% de aluminio excretado vía urinaria.. En relación al grupo Do2, la máxima concentración de aluminio excretado vía renal es de 11.257 ± 0.358 mg/L que representa un porcentaje de eliminación del 52.59%. 83 SUGERENCIAS 1) Realizar estudios similares con otros metales tóxicos liberados por la arcilla. 2) Analizar la posible acumulación del aluminio en los principales órganos. 3) Determinar la cantidad de aluminio que podría ser ingerido y que no represente un riesgo para la salud 84 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Carretero, M. I., Gomes, C. S. F., and Tateo, F. (2013) Clays, Drugs, and Human Health, 5, 711-764. [2] Desideri, D., Meli, M., Roselli, C., and Feduzi, L. 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Part II: dose-dependent urinary and biliary excretion., J Pharm Sci 10, 946–951. 92 ANEXOS ANEXO 1 Tratamiento de la arcilla Triturado Lavado Centrifugado Partículas de > 75 Secado 60° por 24 µ Tamizado < 150 µ. horas ANEXO 2 Verificación del método en ICP OES 93 ANEXO 3 Cantidad de aluminio liberado (mg/L) de 50 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución pH 1.2 pH 4.5 pH 6.8 J. gástrico J. intestinal Tiempo Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS 3 0.251 0.002 0.318 0.005 0.800 0.005 0.321 0.005 0.944 0.010 5 0.272 0.003 0.723 0.012 0.840 0.014 0.345 0.005 0.983 0.018 10 0.281 0.001 0.805 0.004 0.863 0.013 0.374 0.005 1.033 0.003 15 0.296 0.003 0.890 0.006 0.916 0.007 0.398 0.001 1.093 0.006 20 0.300 0.002 0.959 0.001 0.932 0.012 0.436 0.005 1.276 0.022 25 0.298 0.002 0.955 0.003 0.983 0.010 0.455 0.007 1.279 0.009 30 0.307 0.003 0.958 0.018 1.100 0.005 0.484 0.007 1.270 0.007 40 0.315 0.003 0.940 0.009 1.107 0.013 0.607 0.002 1.257 0.020 50 0.417 0.001 0.939 0.006 1.116 0.010 0.638 0.001 1.259 0.005 60 0.574 0.009 0.952 0.006 1.112 0.014 0.641 0.013 1.268 0.014 70 0.576 0.002 0.935 0.011 1.097 0.013 0.641 0.011 1.273 0.021 80 0.570 0.010 0.932 0.010 1.093 0.004 0.632 0.005 1.256 0.016 90 0.569 0.008 0.934 0.009 1.103 0.002 0.640 0.007 1.279 0.019 Cantidad de aluminio liberado (mg/L) de 250 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución pH 1.2 pH 4.5 pH 6.8 J. gástrico J. intestinal Tiempo Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS 3 0.578 0.006 1.004 0.006 1.210 0.013 0.885 0.010 1.437 0.013 5 0.622 0.011 1.066 0.017 1.275 0.015 0.905 0.009 1.508 0.021 10 0.749 0.008 1.056 0.005 1.293 0.006 0.947 0.006 1.636 0.018 15 0.801 0.003 1.083 0.009 1.448 0.020 0.939 0.004 1.899 0.029 20 0.791 0.006 1.433 0.013 1.445 0.024 0.987 0.017 2.253 0.013 25 0.815 0.011 1.583 0.015 1.531 0.013 0.995 0.009 2.283 0.011 30 0.786 0.008 1.565 0.004 1.973 0.012 1.196 0.015 2.254 0.009 40 0.787 0.008 1.527 0.023 1.981 0.029 1.324 0.013 2.246 0.009 50 0.841 0.016 1.542 0.022 1.974 0.007 1.332 0.006 2.257 0.006 60 0.991 0.011 1.534 0.021 2.002 0.019 1.365 0.009 2.228 0.019 70 1.000 0.014 1.542 0.010 2.026 0.019 1.391 0.013 2.286 0.016 80 1.021 0.008 1.620 0.010 2.022 0.034 1.405 0.024 2.235 0.014 90 1.007 0.015 1.603 0.023 2.240 0.015 1.404 0.010 2.273 0.026 94 Cantidad de aluminio liberado (mg/L) de 500 mg de arcilla en los diferentes medios de disolución pH 1.2 pH 4.5 pH 6.8 J. gástrico J. intestinal Tiempo Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS Promedio DS 3 1.082 0.019 1.020 0.004 1.216 0.017 1.261 0.017 1.663 0.017 5 1.161 0.015 1.017 0.017 1.333 0.021 1.362 0.024 1.789 0.007 10 1.138 0.005 1.073 0.012 1.453 0.015 1.399 0.027 1.900 0.036 15 1.176 0.004 1.023 0.005 1.440 0.017 1.403 0.018 2.215 0.014 20 1.231 0.020 1.391 0.023 1.573 0.025 1.570 0.009 2.849 0.024 25 1.222 0.008 1.753 0.024 1.529 0.017 1.561 0.010 2.822 0.026 30 1.282 0.003 1.727 0.005 2.124 0.014 1.689 0.016 3.019 0.014 40 1.277 0.014 1.721 0.023 2.412 0.033 1.938 0.026 2.905 0.010 50 1.304 0.007 1.715 0.026 2.383 0.042 1.935 0.025 2.926 0.038 60 1.452 0.015 1.701 0.004 2.538 0.009 1.912 0.018 2.984 0.009 70 1.478 0.020 1.656 0.008 2.679 0.031 1.865 0.016 2.926 0.031 80 1.526 0.013 1.761 0.035 2.849 0.028 1.933 0.016 3.057 0.019 90 1.533 0.019 1.720 0.029 2.867 0.041 1.902 0.007 3.022 0.009 ANEXO 4 4.1 Prueba post-hoc (Tukey HSD) 50 mg Tiempos Grupos homogéneos 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 95 pH 6.8 pH 4.5 pH 1.2 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 4.2 Prueba post-hoc (Tukey HSD) 250 mg Tiempos Grupos homogéneos 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 96 p pH 4.5 pH 1.2 Jugo intestinal simulado Jugo gástrico simulado H 6. 8 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 4.3 Prueba post-hoc (Tukey HSD) 500 mg Tiempos Grupos homogéneos 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 97 pH 4.5 pH 1.2 Jugo intestinal simulado Jugo gástrico simulado 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 3 X 5 X 10 X 15 X 20 X 25 X 30 X 40 X 50 X 60 X 70 X 80 X 90 X 98 Jugo intestinal simulado Jugo gástrico simulado pH 6.8 ANEXO 5 Áreas bajo la curva y Tiempo Áreas bajo la curva (ABC) en los diferentes medios (min) pH 4.5 J. Gástrico pH 1.2 J. Intestinal pH 6.8 3 1.623 1.530 1.824 1.892 2.495 5 2.243 2.037 2.549 2.623 3.452 10 5.748 5.225 6.965 6.903 9.223 15 5.785 5.240 7.233 7.005 10.288 20 6.018 6.035 7.533 7.433 12.660 25 6.133 7.860 7.755 7.828 14.178 30 6.260 8.700 9.133 8.125 14.603 40 12.795 17.240 22.680 18.135 29.620 50 12.905 17.180 23.975 19.365 29.155 60 13.780 17.080 24.605 19.235 29.550 70 14.650 16.785 26.085 18.885 29.550 80 15.020 17.085 27.640 18.990 29.915 90 15.295 17.405 28.580 19.175 30.395 𝑨𝑩𝑪𝑻 𝟎 118.254 139.402 196.556 155.592 245.082 Tmax. 90.000 90.000 90.000 90.000 90.000 Q100 1.533 1.761 2.867 1.938 3.057 (Q100 x 137.970 158.490 258.030 174.420 275.130 Tmax). EF% 85.710 87.956 76.175 89.205 89.078 MDT 12.861 8.744 21.442 8.009 8.799 ANEXO 6 Pesos de los animales de experimentación Control Do 1 Do 2 negativo 225.000 224.000 237.000 221.000 226.000 221.000 228.000 223.000 224.000 226.000 222.000 223.000 224.000 230.000 226.000 230.000 221.000 228.000 222.000 225.000 225.000 222.000 221.000 225.000 Promedio 224.750 224.000 226.125 DS 3.151 3.024 4.853 RSD 1.402 1.350 2.146 99 ANEXO 7 Cantidad de aluminio liberado (ppm) en muestras de sangre Control negativo Do 1 Do 2 Hora [Al] ppm DS [Al] ppm DS [Al] ppm DS 0 0.411 0.009 0.412 0.010 0.410 0.010 1 0.410 0.010 7.550 0.320 9.194 0.291 2 0.407 0.018 9.200 0.458 18.481 0.917 4 0.409 0.007 16.950 0.830 20.869 1.025 6 0.413 0.010 18.644 0.876 21.406 0.968 8 0.412 0.011 18.381 0.890 20.869 1.007 10 0.412 0.010 16.300 0.766 18.906 0.887 14 0.409 0.007 12.863 0.616 15.788 0.720 18 0.411 0.008 10.631 0.521 14.081 0.655 24 0.414 0.012 7.669 0.374 10.488 0.515 ANEXO 8 Prueba post-hoc (Tukey HSD) a muestras de sangre Tiempo Grupos homogéneos 0 X 1 X 2 X 4 X 6 X 8 X 10 X 14 X 18 X 24 X 0 X 1 X 2 X 4 X 6 X 8 X 10 X 14 X 18 X 24 X 0 X 1 X 2 X 4 X 6 X 8 X 10 X 14 X 18 X 24 X 100 Do 2 Do 1 Control negativo ANEXO 9 Concentración de aluminio (ppm) excretado en orina Horas [Al] DS ppm 24 0.318 0.015 48 0.320 0.014 72 0.321 0.015 96 0.322 0.015 24 8.351 0.298 48 7.866 0.312 72 6.423 0.238 96 5.966 0.290 24 11.257 0.358 48 10.769 0.338 72 7.348 0.308 96 7.041 0.341 ANEXO 10 Pruebas post-hoc a muestras de orina Tiempo (h) Grupos homogéneos 24 X 48 X 72 X 96 X 24 X 48 X 72 X 96 X 24 X 48 X 72 X 96 X 101 Do 2 Do 1 Control Do 2 Do 1 Control negativo negativo ANEXO 11 Volumen urinario del grupo control negativo Tiempo (h) 24 48 72 96 Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) 0.400 0.250 0.350 0.250 0.350 0.350 0.380 0.300 0.450 0.350 0.350 0.500 0.250 0.250 0.350 0.280 0.245 0.245 0.345 0.345 0.400 0.345 0.345 0.400 0.350 0.300 0.250 0.350 0.330 0.280 0.380 0.330 Promedio 0.347 0.296 0.344 0.344 Ds 0.072 0.047 0.041 0.078 Volumen urinario del grupo Do 1 Tiempo (h) 24 48 72 96 Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) 0.550 0.600 0.550 0.500 0.700 0.500 0.650 0.520 0.750 0.450 0.500 0.650 0.590 0.500 0.600 0.580 0.650 0.600 0.620 0.500 0.700 0.600 0.650 0.550 0.750 0.520 0.600 0.600 0.680 0.550 0.620 0.620 Promedio 0.671 0.54 0.59875 0.565 Ds 0.072 0.057 0.051 0.057 Volumen urinario del grupo Do 2 Tiempo (h) 24 48 72 96 Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) Volumen (mL) 1.500 1.400 0.900 1.250 1.500 0.950 1.200 1.000 1.360 1.250 1.250 1.200 1.450 1.200 1.200 1.250 1.800 1.250 1.100 1.360 1.800 1.350 1.200 0.900 1.500 0.900 1.350 1.200 1.750 1.450 1.250 0.900 Promedio 1.583 1.219 1.181 1.133 Ds 0.173 0.200 0.133 0.175 102 ANEXO 12 Cantidad de aluminio excretado por orina (µg) Grupos Tiempo Promedio DS Volumen DS Cantidad de DS (h) [Al] ppm urinario aluminio excretada (µg) 24 0.318 0.015 0.347 0.072 0.110 0.001 48 0.320 0.014 0.296 0.047 0.095 0.001 72 0.321 0.015 0.344 0.041 0.110 0.001 96 0.322 0.015 0.344 0.078 0.111 0.001 Do 1 24 8.351 0.298 0.671 0.072 5.605 0.021 48 7.866 0.312 0.540 0.057 4.248 0.018 72 6.423 0.238 0.599 0.051 3.845 0.012 96 5.966 0.290 0.565 0.057 3.371 0.016 Do 2 24 11.257 0.358 1.583 0.173 4.025 0.566 48 10.769 0.338 1.219 0.200 3.637 0.412 72 7.348 0.308 1.181 0.133 2.263 0.364 96 7.041 0.341 1.133 0.175 2.398 0.386 103 Control negativo ANEXO 13 Dictamen del Comité de Ética Institucional de Investigación de la Universidad Católica de Santa María 104 105 106 107