UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA ESCUELA DE POSTGRADO MAESTRÍA EN QUÍMICA DEL MEDIO AMBIENTE “DISEÑO, CONSTRUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN OPTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE PLOMO(II) Y MERCURIO(II) EN SOLUCIÓN, AREQUIPA – 2016” Tesis presentada por el Bachiller: Mayron Antonio Candia Puma Para optar el Grado Académico de: Maestro en Química del Medio Ambiente Asesor: José Antonio Villanueva Salas, PhD AREQUIPA – PERÚ 2016 DEDICATORIA A Dios, quién siempre está a mi lado, dándome fuerzas para seguir adelante y poniendo en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante este periodo de estudios. A mi familia, por quererme y apoyarme siempre, me han dado todo lo que soy como persona, mis valores, mis principios, mi carácter, mi empeño, mi perseverancia, mi coraje para conseguir mis objetivos. AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis más profundos agradecimientos a las personas que me apoyaron en el transcurso de este trabajo de investigación: A mi familia, por el apoyo incondicional que me brindaron para poder desarrollarme y llegar a este momento. A mis profesores de la Maestría en Química del Medio Ambiente, los cuales me guiaron con sus conocimientos y aliento durante este tiempo. A la Universidad Católica de Santa María; Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica - CONCYTEC y al Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico e Innovación Tecnológica – FONDECYT, por el apoyo brindado a través del Convenio de Gestión No 016-2013-FONDECYT. El científico no tiene por objeto un resultado inmediato. El no espera que sus ideas avanzadas sean fácilmente aceptadas. Su deber es sentar las bases para aquellos que están por venir y señalar el camino. Nikola Tesla ÍNDICE RESUMEN ................................................................................................................... 1 ABSTRACT ................................................................................................................. 3 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 5 HIPÓTESIS .................................................................................................................. 7 OBJETIVOS ................................................................................................................ 8 CAPÍTULO I ................................................................................................................ 9 MARCO CONCEPTUAL ......................................................................................... 9 1. Sensor ................................................................................................................. 9 1.1. Optodo.......................................................................................................... 10 1.1.1. Definición de Optodo ............................................................................ 10 1.1.2. Principio de funcionamiento de los optodos ......................................... 11 1.1.2.1. Absorción ......................................................................................... 14 1.1.3. Tipos de Optodos .................................................................................. 14 1.1.3.1. Optodos de superficie (surface optodes) .......................................... 15 1.1.3.2. Optodos de matriz tridimensional (bulk optodes) ............................ 15 1.1.4. Componentes de la membrana del optodo ............................................ 16 1.1.4.1. Ionóforo ............................................................................................ 16 1.1.4.2. Cromoionóforo ................................................................................. 17 1.1.4.2.1. Ditizona ....................................................................................... 17 1.1.4.3. Matriz ............................................................................................... 18 1.1.4.3.1. Policloruro de Vinilo (PVC) ........................................................ 19 1.1.4.4. Plastificante ...................................................................................... 19 1.1.5. Instrumentación de los optodos ............................................................ 20 1.1.5.1. Fuente de luz .................................................................................... 20 1.1.5.1.1. Diodo Emisor de Luz – Rojo, Verde y Azul (Led RGB) ............ 21 1.1.5.2. Fotodetector...................................................................................... 21 1.1.5.2.1. Resistor Dependiente de la Luz (LDR) ....................................... 22 1.1.5.3. Transductor ...................................................................................... 22 2. Metales Pesados ................................................................................................ 23 2.1. Plomo ........................................................................................................... 24 2.1.1. Plomo en el ambiente ............................................................................ 24 2.1.2. Toxicidad por plomo ............................................................................. 25 2.1.3. Lineamientos de exposición al plomo .................................................. 26 2.2. Mercurio ....................................................................................................... 27 2.2.1. Mercurio en el ambiente ....................................................................... 28 2.2.2. Toxicidad por mercurio ........................................................................ 28 2.2.3. Lineamientos de exposición al mercurio .............................................. 29 3. ICP-OES ........................................................................................................... 29 CAPÍTULO II ............................................................................................................ 31 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 31 1. Materiales y Equipos ........................................................................................ 31 1.1. Reactivos ...................................................................................................... 31 1.2. Materiales ..................................................................................................... 32 1.3. Equipos ........................................................................................................ 32 2. Metodología ...................................................................................................... 33 2.1. Diseño del optodo ........................................................................................ 33 2.1.1. Diseño de los circuitos electrónicos ...................................................... 33 2.1.2. Diseño del modelo ................................................................................ 33 2.2. Construcción del optodo .............................................................................. 33 2.2.1. Construcción de los circuitos electrónicos ............................................ 33 2.2.2. Construcción del cuerpo ....................................................................... 34 2.2.3. Ensamblado y acoplamiento ................................................................. 34 2.2.4. Preparación de la membrana ................................................................. 34 2.3. Evaluación del optodo.................................................................................. 34 2.3.1. Características espectrales de la membrana .......................................... 34 2.3.2. Ajuste de la λ emitida por la fuente de luz............................................ 35 2.3.3. Efecto del pH ........................................................................................ 35 2.3.4. Tiempo de respuesta ............................................................................. 35 2.3.5. Rango dinámico .................................................................................... 36 2.3.6. Límite de detección ............................................................................... 36 2.3.7. Límite de saturación .............................................................................. 36 2.3.8. Repetibilidad y Reproducibilidad ......................................................... 36 2.3.9. Estabilidad a corto plazo ....................................................................... 36 2.3.10. Selectividad ........................................................................................... 37 2.3.11. Tiempo de vida ..................................................................................... 37 2.3.12. Regeneración ........................................................................................ 37 2.3.13. Comparación con un método estándar (ICP-OES) ............................... 37 CAPÍTULO III ........................................................................................................... 38 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 38 1. Diseño del optodo ............................................................................................. 38 1.1. Diseño de los circuitos electrónicos .......................................................... 38 1.2. Diseño del modelo ..................................................................................... 40 2. Construcción del optodo ................................................................................... 41 2.1. Construcción de los circuitos electrónicos ................................................ 41 2.2. Construcción del cuerpo ............................................................................ 42 2.3. Ensamblado y acoplamiento ...................................................................... 43 2.4. Preparación de la membrana...................................................................... 44 3. Evaluación del optodo ...................................................................................... 45 3.1. Características espectrales de la membrana............................................... 45 3.2. Longitud de onda emitida por la fuente de luz .......................................... 47 3.3. Procedimiento y principio de medición ..................................................... 48 3.4. Efecto del pH ............................................................................................. 49 3.5. Tiempo de respuesta .................................................................................. 51 3.6. Rango dinámico ......................................................................................... 52 3.7. Límite de detección ................................................................................... 52 3.8. Límite de saturación .................................................................................. 53 3.9. Repetibilidad y Reproducibilidad .............................................................. 55 3.10. Estabilidad a corto plazo............................................................................ 56 3.11. Tiempo de vida .......................................................................................... 58 3.12. Regeneración ............................................................................................. 60 3.13. Selectividad ............................................................................................... 62 3.14. Comparación con un método estándar (ICP-OES) .................................... 63 CONCLUSIONES ..................................................................................................... 65 SUGERENCIAS ........................................................................................................ 66 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 67 ANEXOS ................................................................................................................... 77 RESUMEN En los últimos años, la liberación de iones de metales pesados en el medio ambiente ha atraído gran atención en todo el mundo debido a su toxicidad y su amplio uso. El mercurio(II) y plomo(II) pueden tener efectos graves sobre la salud humana y el medio ambiente. Por lo tanto, la determinación periódica de sus niveles en los ecosistemas acuáticos es una tarea importante. Como resultado, durante la década pasada, el desarrollo de optodos para la determinación de iones de metales pesados ha llegado a expandirse rápidamente en el área de la química analítica medioambiental, ya que ofrecen ventajas tales como un bajo costo, respuesta relativamente rápida, preparación y procedimiento simples, rango de respuesta amplio, selectividad razonable, sensibilidad alta y aplicabilidad en campo. Un optodo para la determinación de Hg(II) y Pb(II) fue desarrollado en la presente investigación. El optodo estuvo basado en la interacción de Hg(II) y Pb(II) con la ditizona (Dz) inmovilizada en una membrana de PVC. Estas membranas fueron colocadas en un dispositivo que utilizó como fuente de luz y detector, un LED RGB y una resistencia dependiente de la luz (LDR), respectivamente. Por otro lado, el optodo fue acoplado a un registrador de datos de alta resolución (ADC-16 Pico® Technology), que a su vez estuvo conectado a un computador portátil vía USB. Este registrador de 1 datos se usó junto al programa informático PicoLog Recorder, ambos permitieron reconocer, registrar y visualizar los cambios de voltaje (mV) producidos por el optodo en el proceso de determinación del Hg(II) y Pb(II). Los parámetros que afectan la respuesta del optodo como, pH, estabilidad a corto plazo, tiempo de vida, reproducibilidad y repetibilidad fueron estudiados. La selectividad del optodo fue estudiada en presencia de varios iones metálicos. El optodo ha mostrado rangos dinámicos lineales de 0.10-3.25 μg. mL-1 (5.0×10−7–1.6×10−5 mol L-1) y 0.08-3.50 μg. mL-1 (3.6×10−7-1.7x10−5 mol L-1), límites de detección de 0.018 μg. mL-1 (9.0x10-8 mol L-1) y 0.012 μg. mL-1 (6.0x10-8 mol L-1), tiempos de respuesta de 10-13 y 9-13 min; para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. El optodo pudo ser regenerado satisfactoriamente una sola vez, mediante tratamiento con una solución de yoduro 0.01 mol L-1, esto fue necesario una vez que la membrana del optodo se saturó. El desempeño del optodo fue evaluado, mediante la comparación del optodo propuesto con un método estándar (ICP-OES). Para lo cual, Hg(II) y Pb(II) fueron determinados en muestras reales de agua. Los resultados obtenidos demostraron que no existe diferencia estadísticamente significativa entre ambos métodos. 2 ABSTRACT In recent years, the release of heavy metal ions into the environment has attracted great attention worldwide because of their toxicity and widespread use. Mercury(II) and lead(II) can have severe effects on human health and the environment. Therefore, determination their levels in aquatic ecosystems is an important task. As a result, during the past decade, the development of optodes for the determination of heavy metal ions has come to expand rapidly in the area of environmental analytical chemistry, because they offer advantages such as, low cost, relatively fast response, simple preparation and procedure, wide response range, reasonable selectivity, high sensitivity and field applicability. A optode for the determination of Hg(II) and Pb(II) was developed in the present investigation. The optode was based on the interaction of Hg (II) and Pb(II) with dithizone (Dz) immobilized on a PVC membrane. These membranes were placed in a device used as light source and detector, a RGB LED and dependent light resistance (LDR), respectively. On the other hand, optode was coupled a data recorder high resolution (ADC-16 Pico® Technology), which in turn was connected to a laptop via USB. This data recorder was used next to PicoLog Recorder software, both allowed to 3 recognize, record and display changes voltage (mV) produced by the optode in the process of determining the Hg(II) and Pb(II). Parameters affecting the optode response such as, pH, short-term stability, lifetime, reproducibility and repeatability were studied. The selectivity of the optode was studied in the present of several metal ions. The optode had displayed linear dynamic range of 0.10-3.25 μg. mL-1 (5.0×10−7–1.6×10−5 mol L-1) and 0.08-3.50 μg. mL-1 (3.6×10−7-1.7x10−5 mol L-1), limits of detection of 0.018 μg. mL-1 (9.0x10-8 mol L-1) and 0.012 μg. mL-1 (6.0x10-8 mol L-1), response times of 10-13 and 9-13 min; for Hg(II) and Pb(II), respectively. The optode could be regenerated successfully one time, after treating with 0.01 mol L-1 iodide solution. This was required once optode membrane was saturated. The optode performance was evaluated, through comparing of the optode proposed with a standard method (ICP-OES). For which, Hg(II) and Pb(II) was determined in real water samples. The results showed that not exist statistically significant difference between both methods. 4 INTRODUCCIÓN La contaminación del agua causada por iones de metales pesados es un problema local, regional y global. Debido a que estos son altamente tóxicos, no biodegradables, no metabolizables, pueden causar muchas anomalías biológicas y tienden a acumularse en las cadenas alimenticias.1 El Pb(II) y Hg(II) son dos de los más peligrosos iones de metales pesados. La amplia presencia de Pb(II) en el ambiente, se da debido a las actividades antropogénicas. Las fuentes de exposición a Pb(II) más importantes son las emisiones industriales, suelos, gases de escape de los vehículos y alimentos contaminados. El agua y los alimentos pueden contener niveles altos de plomo si están cercanos a una fuente de exposición.2 El Pb(II) es altamente toxico para los sistemas nervioso, inmune y gastrointestinal de los seres humanos y animales.3 Por otro lado, aunque el Hg(II) no es un elemento químico abundante en la naturaleza, su presencia ha aumentado como resultado de muchas aplicaciones industriales y agrícolas. Debido a su alta toxicidad y bioacumulación en la cadena alimenticia, el monitoreo de Hg(II) en aguas naturales es muy importante.2 El Hg(II) puede causar daño al cerebro, los riñones y al sistema inmunológico.3 Debido a la toxicidad elevada de estos iones de metales pesados en el agua, los estándares de calidad ambiental de agua (A3) para Hg y Pb recomendados por Ministerio del Ambiente del Perú son 0.002 y 0.05 mg. L-1, respectivamente.4 5 Existen varios métodos por los cuales se puede detectar estos metales pesados. Estos métodos incluyen a la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), espectrometría de emisión óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP-OES), espectrometría de emisión atómica con plasma inductivamente acoplado (ICP-AES), espectroscopia de absorción atómica de flama (FAAS), espectrometría de fluorescencia atómica (AFS), análisis de activación por neutrones (NAA) y voltamperometría.5 Sin embrago, estos métodos requieren equipos sofisticados y caros, procedimientos complicados y personal calificado. Adicionalmente, estos no son adecuados para salir del laboratorio o monitorear en campo.6 Un optodo es un sensor óptico-químico, que está basado en la interacción del analito con la interfaz sensible, esta interacción produce información química manifestada en forma óptica, que es traducida en una señal analíticamente útil, generalmente de dominio eléctrico. Además, la determinación de iones de metales pesados por medio de diferentes optodos ha ido incrementándose desde hace aproximadamente tres décadas.7-9 Esto es debido a ventajas tales como su fácil fabricación, tamaño reducido, bajo costo, sensibilidad razonable, sensibilidad alta y aplicabilidad en campo.10 La ditizona (Dz) posee grupos azo y sulfhidrilos, los cuales pueden formar complejos estables con muchos iones metálicos bajo condiciones apropiadas. Su inespecificidad hacia diferentes iones metálicos es una desventaja, que se ha visto reducida mediante el control del pH. La formación de complejos con Hg(II) y Pb(II), se ve favorecida a pH 1-4 y 4.5-8.5 respectivamente.11 Debido a todas estas características, la Dz ha sido usada como cromoionóforo en la elaboración de membranas de optodos.12-14 El presente trabajo de investigación reporta el diseño, construcción y evaluación de un optodo para la determinación de Pb(II) y Hg(II) en solución, el cual estuvo basado en la inmovilización de Dz en una membrana de PVC. El dispositivo propuesto, consta de un resistor dependiente de la luz (LDR) como detector, LED RGB como fuente de luz y un cuerpo de poliamida. Además, este dispositivo esta acoplado a un registrador de datos y a un software de adquisición de datos. En conjunto el presente optodo fue aplicado satisfactoriamente para la determinación de Pb(II) y Hg(II) en solución. 6 HIPÓTESIS Dado que la ditizona puede formar complejos con el Hg(II) y Pb(II) a diferentes condiciones de pH, es probable que, esta pueda ser usada como interfaz sensible de un optodo, mediante su inmovilización en una membrana de PVC, que sirva para la determinación de Hg(II) y Pb(II) en solución con ventajas sobre métodos convencionales. 7 OBJETIVOS  Diseñar y construir un optodo basado en la inmovilización de ditizona en una membrana de PVC, que responda a Pb(II) y Hg(II) en solución.  Evaluar si dicha respuesta es analíticamente aceptable para la determinación de estos elementos en solución, según los factores que puedan intervenir en el proceso.  Comparar dicha respuesta con un método estándar (ICP-OES). 8 CAPÍTULO I MARCO CONCEPTUAL 1. Sensor La palabra sensor viene del latín “sentire”, que significa “percibir”, originado en 1350-1400.15 Se denomina sensor al dispositivo analítico capaz de responder en continuo, in situ, en tiempo real y de modo reversible a los cambios producidos en un parámetro físico o en la concentración de una especie química.16 El diagrama esquemático de un sensor se representa en la Fig. 1. Un sensor está compuesto por dos componentes principales: una interfaz sensible y un transductor. La interfaz sensible es capaz de interactuar con un mensurando objetivo y causar un cambio en el funcionamiento del transductor. Afectado por este cambio, el transductor produce una señal, que se traduce en información legible por un sistema de adquisición de datos.15 Fig. 1 Diagrama esquemático de un sensor 15 Los sensores pueden ser utilizados para medir o detectar una amplia variedad de mensurandos físicos, químicos y biológicos, incluyendo proteínas, bacterias, productos químicos, gases, intensidad de la luz, movimiento, posición, sonido y muchos otros.17 Un sensor debe ser sensible a su mensurando objetivo, e insensible a cualquier otra magnitud de entrada, la cual podría afectar su rendimiento. Como una regla universal, los sensores deben proporcionar fiabilidad, exactitud, precisión, estabilidad, generalmente detección de bajo precio.18 1.1. Optodo 1.1.1. Definición de Optodo Un optodo es un sensor óptico-químico, que está basado en la interacción del analito y la interfaz sensible, la cual produce información química manifestada en forma óptica, que es traducida en una señal analíticamente útil, generalmente de dominio eléctrico. Las aplicaciones de los optodos han aumentado rápidamente en las últimas tres décadas. Inicialmente estos sensores óptico-químicos han sido denominados de dos formas: “optrodo” basado en el nombre más antiguo de “electrodo” y el nombre “optodo”, derivado de “óptico”.19 Este último ha sido utilizado con mayor frecuencia. En los optodos, la interfaz sensible consiste en colorantes reactivos inmovilizados en matrices orgánicas o inorgánicas.16 La interacción de estos reactivos con el analito provoca un cambio en el comportamiento de la absorbancia,20 fluorescencia21 o reflectancia22 de la interfaz sensible, aplicada en la determinación de diversos analitos, por ejemplo, iones metálicos.9, 23-28 En otras palabras, el indicador actúa como un transductor para especies químicas que no pueden ser determinadas directamente por medios ópticos. Los optodos presentan las siguientes ventajas: tamaño reducido, bajo costo, simplicidad, no necesitan soluciones de referencia, selectividad razonable, sensibilidad alta y son aplicables en campo.29, 30 1.1.2. Principio de funcionamiento de los optodos La operación fundamental de un optodo consiste en tres pasos principales: la interacción entre la interfaz sensible y el analito, por medio de cualquiera de los diferentes mecanismos que son esquematizados en la Fig. 2; la detección y la transducción de cualquier variación física o química causada por las reacciones de reconocimiento; y el procesamiento de señales, incluyendo la adquisición de los resultados. El funcionamiento de los optodos se basa en la preconcentración del analito en un sustrato sólido (membrana) que produce un cambio en la propiedad óptica del sustrato sólido que es proporcional a la concentración de analito.31 La medición de la variación de la propiedad óptica (absorción, reflectancia, luminiscencia, fluorescencia, centelleo, índice de refracción, etc.) de la fase sólida puede ser utilizada para la detección y cuantificación del analito objetivo.32 Fig. 2 Mecanismos de interacción química, componentes básicos de la instrumentación de un optodo y su funcionamiento. Mecanismos: medición directa de compuestos químicos que exhiben propiedades espectroscópicas (1A) y la medición de luz originada desde una reacción química o biológica en un fenómeno de quimioluminiscencia o bioluminiscencia (1B); optodos basados en la interacción de indicadores y cromoionóforos con la luz, los cuales son inmovilizados en un soporte (2); y optodos que modifican las propiedades físicas o químicas intrínsecas de una guía de ondas (índice de refracción, fase, etc.) como consecuencia de la presencia del analito (3A), una interfaz sensible (3B), un analito intermedio (3C) o un indicador (3D).33 En las membranas de optodos, el método más común se basa en un intercambio de iones entre una fase hidrófoba que contiene un cromoionóforo selectivo, capaz de unirse al ion metálico de una solución acuosa, que cambia de color o fluorescencia debido a la liberación de protones cuando ión metálico es captado y este cambio es proporcional a su concentración.34 La difusión de los cationes y el desequilibrio de la carga en la membrana causa que el cromoionóforo libere H+ y su color cambie en la forma desprotonada.35 En la Fig. 3 se muestra los mecanismos de acción en membranas de optodos. En el caso de intercambio catiónico (a) El uso de un indicador neutro necesita una compensación de carga y una fase de transferencia por los sitios aniónicos. (b) Si el indicador esta negativamente cargado, tanto H+ y IL+ compiten por una compensación de carga del indicador, dependiendo del pKa y el pH de la solución acuosa. En el caso de una extracción iónica (c) Se da una extracción directa del analito por medio del ionóforo, por otro lado, el indicador capta H+ para mantener la neutralidad de la membrana.36 Fig. 3 Diagramas de los mecanismos de acción en membranas de optodos. (a,b) Membranas de intercambio catiónico que incorporan un ionóforo selectivo para cationes eléctricamente neutral, L, ya sea con un indicador básico (neutral), Ind, y sitios lipofílicos aniónicos, R- (a), o con un indicador ácido (cargado negativamente), Ind- (b); (c) Membranas de extracción iónica que incorporan un ionóforo selectivo para aniones eléctricamente neutral, C, y un indicador básico, Ind.36 La respuesta del optodo depende de la manera en la cual el analito interacciona con el transductor químico. Por ejemplo, un reactivo (R) reacciona con un analito (A) formando un producto (AR). Entonces, ya sea R o AR, usualmente presenta absorción o luminiscencia, y por lo tanto pueden ser medidos ópticamente. El reactivo empleado es generalmente selectivo, produciendo un cambio óptico distinto para determinado analito. Durante la reacción química, el reactivo R es consumido y, por lo tanto, la absorbancia o luminiscencia decrece, o la formación del producto AR aumenta la absorbancia o luminiscencia. De cualquier manera, el cambio en la propiedad óptica de R o AR puede estar relacionada con su concentración y, a su vez, relacionada con la concentración del analito A causando cambios en la propiedad óptica medida.37 1.1.2.1. Absorción La absorción de energía óptica da lugar a transiciones en los estados de energía electrónico, vibracional y/o rotacional, de los átomos y moléculas, y sólo se produce si la diferencia en los estados de energía implicados coincide exactamente con la energía de excitación de los fotones. La radiación visible y ultravioleta induce excitación electrónica, la radiación infrarroja promueve la excitación vibracional, y la radiación de microondas da lugar a las transiciones rotacionales. La absorción conduce a una disminución de la potencia de la radiación a medida que pasa a través de la muestra. Por lo tanto, después de encontrar un número de especies absorbentes, un haz de luz de intensidad inicial (I0) será transmitida por la muestra con una intensidad reducida (I). Debe saberse que sólo las frecuencias que son absorbidas serán atenuadas, y todas las otras frecuencias pasarán a través sin pérdida de potencia. La disminución de la intensidad de la luz es determinada por el número de especies absorbentes en la trayectoria de luz, y esta relaciona con la concentración.38 1.1.3. Tipos de Optodos Los optodos se pueden clasificar según la disposición de los reactivos ópticamente activos, como se representa en la Fig. 4. Fig. 4 Representación esquemática de optodos según la disposición de los reactivos ópticamente activos. a Optodos de superficie: reactivos están directamente inmovilizados sobre un soporte mediante (1) enlaces covalentes, (2) adsorción, (3) interacciones electrostáticas o (4) atrapados en una matriz porosa. b Optodos de matriz tridimensional: (5) reactivos son disueltos en un plastificante.39 1.1.3.1. Optodos de superficie (surface optodes) Su característica principal es que los reactivos ópticamente activos son inmovilizados sobre la superficie de un componente óptico (guía de ondas, placa metálica, vidrio, prisma, etc.) o en una matriz porosa de manera que están en contacto directo con el analito de la muestra. Esta inmovilización puede ser llevada a cabo por medio de enlaces covalentes;40 por interacciones mecánicas, tales como adsorción física;41 por atrapamiento físico o por interacciones electrostáticas.42 La respuesta a un analito determinado viene dada por los equilibrios que se establecen en la interfaz del soporte con la dilución. Estos, a su vez, están controlados por las leyes de difusión de Fick y por las condiciones de adsorción.43 1.1.3.2. Optodos de matriz tridimensional (bulk optodes) Los reactivos están disueltos en una fase orgánica, que es impregnada en una matriz polimérica inerte, formando así, la membrana de detección de los optodos de matriz tridimensional, y su señal se basa en los cambios de concentración dentro de la matriz.44 Estos optodos siguen mecanismos de intercambio iónico entre la membrana y la solución acuosa. La entrada del analito provoca un cambio en las propiedades ópticas de un elemento disuelto en la membrana (cromoionóforo). Por otra parte, la selectividad es gobernada por los coeficientes de distribución de iones entre ambas fases y por las constantes de formación de complejos dentro de la membrana. La principal ventaja de la utilización de este enfoque es que la respuesta no es afectada por la fuerza iónica de la solución.45 1.1.4. Componentes de la membrana del optodo La membrana del optodo, es la interfaz sensible de un optodo, es la parte que proporciona selectividad hacia un analito. Además, determina otros parámetros analíticos como la sensibilidad, tiempo de vida y el intervalo de trabajo. Básicamente está compuesta por un ionóforo o cromoionóforo, un cromóforo (en el caso de que el ionóforo no posea propiedades ópticas), una matriz polimérica y un plastificante.46 1.1.4.1. Ionóforo Los ionóforos o portadores de iones son agentes complejantes lipofilicos capaces de unirse reversiblemente a iones. Se denominan portadores de iones debido a que catalizan el transporte iónico a través de membranas hidrofobicas, aumentando la permeabilidad de estas. Pueden ser especies cargadas (ionóforos cargados) o neutras (ionóforos neutros).47 En una membrana de optodo, y en general en membranas selectivas a iones, la función del ionóforo es esencial: consiste en reconocer al analito selectivamente y transportarlo al interior de la membrana. Con esta finalidad, los requisitos que ha de cumplir un ionóforo son: una alta lipofilicidad, alta selectividad respecto al analito, presentar constantes de formación del complejo analito-ionóforo apropiadas y unirse al analito reversiblemente.48 1.1.4.2. Cromoionóforo Los cromoionóforos son transportadores de iones capaces de presentar cambios en sus propiedades ópticas al interaccionar con el analito. Su estructura química incluye una zona de reconocimiento enlazada a un grupo cromóforo.49 Un grupo cromóforo es una región molecular donde la diferencia energética entre dos orbitales moleculares cae dentro del espectro visible, la cual es responsable de su color. Normalmente se trata de un sistema π conjugado. Cuando el analito es reconocido, este sistema electrónico π se ve modificado, lo que provoca un cambio en las propiedades espectrales (absorción UV-Vis del cromoionóforo). En definitiva, este es un proceso de traducción, donde la información química se transforma en una señal óptica.46 Las características de un cromoionóforo son las mismas que las descritas para un ionóforo (apartado 2.1.1.4.1.) además, este debe presentar una gran variación en sus propiedades ópticas por la interacción con el analito, tener coeficientes de extinción molar altos y ser específicos para un analito determinado. Por otra parte, deben ser fotoquímicamente estables para ser aplicados en situaciones reales, haciendo viable el desarrollo de dispositivos simples, robustos y de bajo costo.50 Una gran variedad de cromoionóforos que cumplen la totalidad o parte de las características mencionadas han sido utilizados.51-53 1.1.4.2.1. Ditizona El reactivo analítico ditizona (también conocida como 1,5-difeniltiocarbazona o 3- tio-1,5-difenilformazán), fue sintetizada por primera en 1878 por Emil Fischer a partir del disulfuro de carbono y la fenilhidrazina.54 La ditizona es insoluble en soluciones acuosas a pH < 7, pero si es soluble en medio alcalino. Las dos formas tautoméricas ceto y enol coexisten en solventes orgánicos.55 La ditizona contiene grupos azo y tiol, los cuales pueden formar complejos estables con muchos iones metálicos bajo condiciones adecuadas, como se muestra en la Fig. 5. Además, se usa ampliamente en métodos de extracción.14 El empleo de ditizona como quelante en procedimientos de extracción líquido-líquido de iones metálicos, donde los analitos se separaron de manera eficiente de la matriz ha sido reportado.56 La principal desventaja de la ditizona es su inespecificidad hacia diferentes iones metálicos. Esta desventaja se ha visto reducida mediante el control del pH. La formación de complejos con mercurio(II) y plomo(II), se ve favorecida a pH 1-4 y 4.5- 8.5 respectivamente.11 Debido a todas estas características, la ditizona ha sido usada como cromoionóforo en la elaboración de membranas de optodos.12, 13, 57 M Fig. 5 Estructura del complejo de ditizona con Hg (II) y Pb (II), M es Hg (II) o Pb (II) 55 1.1.4.3. Matriz La matriz es el medio donde están inmovilizados, ocluidos o disueltos los reactivos responsables de la respuesta química selectiva de un optodo (ionóforo, cromoionóforo y aditivos). Se encarga de conferir a la fase reactiva las propiedades físicas adecuadas, como la estabilidad mecánica y la elasticidad, además de una relativamente alta movilidad de sus componentes.46 Estas matrices están formadas por polímeros reticulados, polímeros plastificados o superficies activadas orgánicas e inorgánicas. Estos deben cumplir con las siguientes funciones básicas: actuar como una interfaz liquido-solido o gas-sólido y, si la radiación pasa a través de ellos permitir la transmisión de la señal, en otras palabras, deben ser materiales ópticamente transparentes. Por otro lado, estas deben permanecer inertes mientras se producen las reacciones químicas que están involucradas en el proceso de reconocimiento. Además, la matriz algunas veces juega el rol de mejorar la selectividad y regula la transferencia de carga.58 La inmovilización de reactivos de detección sobre las matrices es un paso importante en el desarrollo de los optodos. La inmovilización química sobre una matriz apropiada,59 la adsorción en la superficie de la matriz60 y el atrapamiento físico en matrices poliméricas,10 son estrategias comúnmente aplicadas; entre ellas la última es la más utilizada. La elección de la matriz es regida por parámetros tales como: la permeabilidad hacia el analito, la estabilidad mecánica y la capacidad para inmovilizar el cromóforo.31 Entre los polímeros más usados como matrices en los optodos tenemos: PVC, poliuretanos blandos, siliconas, cloruro de polivinilideno, polisiloxanos, Nafion®, etc. 1.1.4.3.1. Policloruro de Vinilo (PVC) El PVC es el polímero más utilizado como matriz en los optodos. Sus principales ventajas son el costo relativamente bajo, buenas propiedades mecánicas y su docilidad a la plastificación.61 El PVC tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) alrededor de 85oC, haciéndose necesaria la adición de un plastificante, ya que los polímeros aptos para ser usados en matrices sensoras deben tener una Tg por debajo de aproximadamente 25 oC.48 El PVC presenta las características requeridas para la matriz de un optodo (apartado 2.1.1.4.3.). 1.1.4.4. Plastificante El plastificante o disolvente mediador es un disolvente orgánico de alto punto de ebullición e inmiscible en agua, cuya función en las membranas de optodos es la formación de una solución homogénea y estable en la que se encuentran disueltos el resto de los componentes y, de esta forma, junto con el polímero, dotan a la membrana de una estructura. Los plastificantes incrementan el flujo y la termoplasticidad de los polímeros, mediante la disminución de su viscosidad y su Tg.62 El plastificante debe presentar las siguientes características: debe ser químicamente inerte, lipofílico y debe asegurar la movilidad de sus constituyentes. La lipofilicidad y la constante dieléctrica son dos de los parámetros que definen a un plastificante. Además, el plastificante tiene la capacidad de modular la selectividad, el intervalo de respuesta y el tiempo de vida de las membranas, debido al efecto sobre la respuesta iónica que tienen algunas de sus propiedades (polaridad, capacidad coordinante y formación de pares iónicos).63 Los plastificantes más usados en las membranas de optodos son: los adipatos, sebacatos, ftalatos y nitroaromáticos.46 1.1.5. Instrumentación de los optodos En cuanto a la instrumentación requerida, usualmente componentes ópticos activos y pasivos son empleados; sin embargo, su complejidad puede variar de acuerdo con los objetivos propuestos. Entre las partes principales se pueden distinguir: a la fuente de luz, el detector y el transductor. 1.1.5.1. Fuente de luz Una fuente de luz es cualquier objeto que puede emitir la parte visible de la radiación electromagnética (400 – 700 nm).64 Esta luz emitida interactúa con el transductor químico, esta interacción resulta en una modulación de la señal óptica, y la luz modulada, que está codificada con información química, es guiada a un sistema de medición de luz (detector). La fuente de luz debe ser capaz de proporcionar una radiación intensa y estable. Varios tipos de fuentes de luz han sido empleados en optodos tales como lámparas incandescentes, láseres de gas, diodos emisores de luz (LEDs) y láseres de semiconductores de inyección.38 1.1.5.1.1. Diodo Emisor de Luz – Rojo, Verde y Azul (Led RGB) Los Leds son dispositivos bipolares y polarizados, de unión p-n, que emiten luz cuando están conectados a una fuente de poder de corriente continua en un solo sentido. Son fuentes en miniatura de alta intensidad de radiación monocromática, producen una luz con un ancho de banda espectral de 40 – 50 nm.65 El Led RGB trabaja con el sistema RGB, el cual consiste en la mezcla aditiva de los tres colores primarios (rojo, verde y azul), que pueden generar un amplio rango de colores,66 Las longitudes de onda de sus colores primarios: azul, verde y rojo son: 465, 525 y 640 nm, respectivamente, por medio de su mezcla se puede obtener todo el espectro visible.67 El material que se usa para elaborar estos dispositivos es el nitruro de galio-indio (InGaN) para el color azul, el InGaN sobre un zafiro para el color verde y el fosfuro de aluminio-galio-indio (AlGaInP) sobre arseniuro de galio (GaAs) para el color rojo.68 1.1.5.2. Fotodetector El sistema de fotodetección es esencialmente un dispositivo de recuento de fotones, donde las señales ópticas son convertidas en señales eléctricas, que pueden ser fácilmente amplificadas por medios electrónicos.69 El fotodetector debe poseer una adecuada sensibilidad a la longitud de onda de medición, debe generar una cantidad mínima de ruido a la señal transmitida y debe responder rápidamente a las variaciones en intensidad de la luz incidente. Varios tipos de fotodetectores han sido incorporados en optodos. Estos incluyen tubos fotomultiplicadores, fotodiodos positivos intrínsecos negativos (PIN), fototransistores y fotorresistencias. Dependiendo del dispositivo de medición y los principios ópticos empleados, la señal óptica medida puede ser absorbancia, reflectancia, luminiscencia, fluorescencia o la dispersión.38 1.1.5.2.1. Resistor Dependiente de la Luz (LDR) El LDR también es conocido como fotoconductor. Este dispositivo utiliza materiales cuya resistencia óhmica varía con el grado de irradiancia. Estos dispositivos emplean al sulfuro de cadmio (CdS) y seleniuro de cadmio (CdSe), debido a que exhiben un comportamiento fotoconductivo y son de bajo costo.69 La resistencia de este tipo de componentes varía en función de la luz que recibe en su superficie. Así, cuando están en oscuridad su resistencia es alta y cuando reciben luz su resistencia disminuye considerablemente. Esto se produce porque, directamente debajo de la banda de conducción del material fotoconductivo hay un nivel donador y por encima de la banda de valencia hay un nivel aceptor. En la oscuridad, los electrones y los huecos en cada nivel están casi aglomerados en su lugar, resultando en una alta resistencia del LDR. Cuando la luz ilumina el material fotoconductivo, los fotones son absorbidos, provocando una energía añadida en la banda de valencia, ocasionando que los electrones vayan hacia la banda de conducción, creando huecos libres en la banda de valencia, incrementando la conductividad del LDR.70 Por otro lado, como se explica en el párrafo anterior, cuando el LDR recibe luz su resistencia es baja, pero esto también depende del circuito que se use, pudiéndose dar lo contrario, cuando el LDR recibe luz su resistencia es alta.71 1.1.5.3. Transductor Un transductor es un componente que convierte una forma de energía en otra, esta conversión es una característica esencial que gobierna el proceso de detección. Existen diferentes tipos de transductores: térmicos, electromagnéticos, químicos, etc.15 En un optodo, existen dos transductores: el cromoionóforo y el fotodetector, el primero permite la conversión de la energía química en energía luminosa, y el segundo produce la conversión de la energía luminosa en energía eléctrica.69 El transductor químico por lo general consiste en reactivo(s) inmovilizado(s) que son específicos para el analito y a menudo son capaces de medir niveles traza del analito.38 La traducción química esta normalmente basada en el equilibrio establecido durante la reacción química entre el analito y el transductor químico. 2. Metales Pesados El término “metal pesado” se refiere a cualquier elemento metal o metaloide que tiene una densidad igual o superior a 5 g. cm-3 cuando está en forma elemental, cuyo número atómico es superior a 20 (excluyendo a los metales alcalinos y alcalino- térreos) y es tóxico a bajas concentraciones. Esta definición incluye al mercurio (Hg), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), talio (Tl), zinc (Zn), níquel (Ni), cobre (Cu) y plomo (Pb).72 Los metales pesados existen normalmente en la corteza terrestre y son encontrados en suelo, rocas, sedimentos, agua y microorganismos a concentraciones naturales. Sin embargo, su liberación antropogénica puede dar lugar a altas concentraciones de estos metales pesados en el ambiente. Como los metales pesados no pueden ser degradados o destruidos, persisten en el ambiente.73 La toxicidad de los metales pesados depende de su forma molecular y su especiación en solución. Sus formas iónicas libres son las formas más toxicas para la biota.74 Aunque los metales pesados de forma individual exhiben signos específicos de su toxicidad, los siguientes han sido reportados como signos generales asociados con el envenenamiento por Cd, Pb, As, Hg, Zn, Cu y Al: desordenes gastrointestinales, diarrea, estomatitis, hemoglobinuria, ataxia, parálisis, vómitos, convulsiones, depresión, etc. La naturaleza de los efectos podría ser toxica (aguda, crónica o subcrónica), neurotóxica, carcinogénica, mutagénica o teratogénica.75 2.1. Plomo El plomo (Pb) es un metal pesado con un color gris azulino que se encuentra de forma natural en la corteza terrestre. Sin embargo, rara vez se encuentra en forma natural como un metal, por lo general se encuentra combinado con dos o más elementos para formar compuestos de Pb como la Galena (PbS), Cerusita (PbCO3) y Anglesita (PbSO4). Estos compuestos de Pb comprenden 0,002% de la corteza terrestre.76 El Pb tiene un peso atómico de 207.2 g. mol-1 y una densidad de 11.34 g. cm-3. Tiene un punto de fusión de 327.46 °C y un punto de ebullición de 1749 °C. Pertenece al Grupo IVA en el sistema de elementos y se encuentra en tres estados de oxidación principales 0, II y IV. En la mayoría de sus compuestos inorgánicos, el Pb está en estado de oxidación de II. Con excepción del nitrato y acetato, las demás sales de Pb(II) son insolubles en agua.77 2.1.1. Plomo en el ambiente Este metal ha sido utilizado por los seres humanos durante miles de años y está muy extendido hoy en día, puede provenir de operaciones de minería, tratamiento de metales, fabricación de equipos eléctricos y quema de combustibles fósiles. Se encuentra en productos como: pinturas y pigmentos, baterías, pesticidas, tubos, pesas, municiones, cubiertas de cables, y dispositivos de protección contra la radiación.78 El rango de concentración de descarga de plomo (II) es de 5-66 mg. L-1 para la industria de las baterías, 0.02-2.5 mg. L-1 para la industria minera y 125-150 mg. L-1 para la industria petrolera.79 Las principales fuentes de plomo en el agua potable son la corrosión de las cañerías en el hogar; y la erosión de depósitos naturales. Las casas antiguas tienen más probabilidades de tener tuberías, accesorios y soldadura con plomo. El plomo entra en el agua a través del contacto con la fontanería. El plomo se filtra en el agua a través de la corrosión, debido a una disolución o desgaste de metales causada por una reacción química entre el agua y la plomería. La cantidad de plomo en el agua también depende de los tipos y cantidades de minerales en el agua, el tiempo que el agua se queda en las tuberías, la cantidad de desgaste en las tuberías, la acidez del agua y la temperatura.80 A pesar de que las principales fuentes de exposición al plomo son la ingestión de partículas de pintura y la inhalación de polvo, la EPA estima que del 10 al 20 por ciento de la exposición humana al plomo puede provenir de plomo en el agua potable. En condiciones normales el plomo no reacciona con el agua. Sin embargo, cuando este entra en contacto con aire húmedo su reactividad con el agua aumenta. Cuando el oxígeno y el agua están presentes, el plomo metálico es convertido a hidróxido de plomo (Pb(OH)2). El plomo orgánico se aplica en la producción de petróleo, y los compuestos de plomo inorgánico se aplican en la producción de baterías y pinturas. El plomo se utiliza para la fabricación de pantallas televisión y ordenadores. El tetraetilo de plomo se aplica como aditivo en combustibles. Estos compuestos orgánicos de plomo se convierten rápidamente a compuestos inorgánicos de plomo, y terminan en el agua, incluso a veces en el agua potable.81 El plomo no es tan tóxico para los organismos marinos como el mercurio o cadmio. Por lo general, los valores cercanos 0.1 mg. L-1 se indican como el umbral donde los efectos adversos se hacen evidentes.82 El plomo es persistente en el ambiente y se acumula en los suelos y sedimentos a través de la deposición desde: el aire, la descarga directa de efluentes a los cuerpos de agua, la minería y la erosión. Los ecosistemas cercanos a las fuentes puntuales de plomo demuestran una amplia gama de efectos adversos, incluyendo: pérdida en biodiversidad, cambios en la composición de la comunidad, disminución de las tasas de crecimiento y reproducción en plantas y animales, y efectos neurológicos en los vertebrados.77 2.1.2. Toxicidad por plomo En adultos la toxicidad aguda por Pb se manifiesta con dolor abdominal, constipación, vómitos, anorexia e hiperirritabilidad, en niveles de Pb en sangre en un rango de 60–100 μg. dL-1. La parálisis nerviosa se da a niveles mayores de Pb en sangre (90–120 μg. dL-1); mientras que los signos de encefalopatía (coma, convulsiones y vómitos explosivos) se ponen en manifiesto solo en niveles de Pb en sangre mayores a 120 μg. dL-1.83 La neuropatía periférica precede a los síntomas neurológicos de la toxicidad por Pb, y ocurre a niveles de Pb en sangre de aproximadamente 50-60 μg. dL-1.84 Los niños que sufren toxicidad aguda por Pb manifiestan síntomas como letargia, convulsiones, anorexia, vómitos, coma y encefalopatía. Ciertos signos son síntomas del trastorno de hiperactividad con déficit de atención (THDA) como la mayor distracción y la incapacidad para inhibir las respuestas del comportamiento inapropiado observado tanto en niños como en animales expuestos a Pb. El Pb puede dañar varios sistemas en el organismo (Ej. renal, hematopoyético y esquelético), pero el sistema nervioso central (SNC) es el blanco principal. El envenenamiento que se produce por el Pb se le denomina saturnismo, plumbosis o plombemia. Niveles de Pb en sangre mayores a 90 μg. dL-1 pueden causar una encefalopatía hemorrágica con edema severo y una alta mortalidad. Esto es en parte debido a la habilidad de este metal de interrumpir la integridad de las células capilares endoteliales de la barrera hematoencefálica, comprometiendo sus funciones.80 Lo más común es la exposición a niveles bajos de Pb, dependiendo de la dosis se observa una disminución en las funciones intelectuales en niños expuestos al Pb durante la primera infancia.85 Este sutil efecto sobre los circuitos neuronales se manifiesta como anomalías en el aprendizaje y el comportamiento, las cuales pueden estar acompañadas de convulsiones recurrentes y retardo mental. La hiperactividad y déficit de atención también han sido reportadas. Aunque no se ha observado ninguna evidencia de lesión cerebral a este nivel de exposición, el déficit neurológico sufrido puede ser permanente.86 2.1.3. Lineamientos de exposición al plomo El centro de control de enfermedades de los Estados Unidos ha revisado los niveles permisibles de Pb en sangre varias veces a lo largo de los años. El rango de referencia fue originalmente establecido en 60 μg. dL-1 (1971), y fue continuamente reduciéndose a 40 μg. dL-1 (1975), 30 μg. dL-1 (1978), 25 μg. dL-1 (1985), 10 μg. dL-1 (1991) y finalmente en 5 μg. dL-1 (2012).87 La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido que los niveles mínimos de Pb en la sangre, a los cuales no se observa un efecto sobre la salud de las personas 5 µg. dL-1, y que sobre esta base la OMS recomienda, un nivel de concentración de Pb en el aire de 0.5 µg. m-3 y en el agua 10 μg. L-1 anual.88 El nivel permisible de plomo en el agua potable es de 0,05 mg. L-1 según el Ministerio del Ambiente del Perú.4 2.2. Mercurio El mercurio (Hg) es el único metal pesado que es líquido a temperatura ambiente (25 oC). El mercurio se encuentra naturalmente en el medio ambiente y existe en varias formas. Las formas naturales más comunes de mercurio son: el mercurio metálico, sulfuro de mercurio (cinabrio), cloruro de mercurio y metilmercurio. Algunos microorganismos (bacterias y hongos) y procesos naturales pueden cambiar al mercurio en el medio ambiente de una forma a otra. El compuesto de mercurio orgánico más común que los microorganismos y procesos naturales generan a partir de otras formas es el metilmercurio.89 El Hg tiene un peso atómico de 200.59 g. mol-1 y una densidad de 13.60 g. cm-3. Tiene un punto de fusión de -38.9 °C y un punto de ebullición de 356.6 °C. Pertenece al Grupo IIB en el sistema de elementos y se encuentra en tres estados de oxidación principales 0, I y II.90 Los siguientes compuestos de mercurio se encuentran con mayor frecuencia en condiciones ambientales: HgCl, Hg(OH) y HgS; el ion de metilmercurio (HgCH + 3 ) y sus compuestos de cloruro de metilmercurio (CH3HgCl) e hidróxido de metilmercurio (CH3HgOH); y en pequeñas fracciones, otros organomercúricos (por ejemplo, dimetilmercurio y fenilmercurio). El metilmercurio se forma cuando el mercurio entra en el suelo o en los sedimentos, y actúa sobre los microorganismos anaerobios. La solubilidad de los compuestos de mercurio varía desde insignificante (HgS) a muy soluble (Hg(NO3) 91 92 2). El Hg(II), es la principal forma de Hg en medios acuáticos. 2.2.1. Mercurio en el ambiente Históricamente, el mercurio y sus compuestos se han utilizado con fines industriales, medicinales, y cosméticos. Los usos modernos del mercurio incluyen la producción de cloro-álcali, en dispositivos de cableado y switches, dispositivos de medición y control, iluminación, preservantes, desinfectantes y trabajo dental.93 Los vertidos urbanos, los materiales agrícolas, la minería, la combustión y los vertidos industriales son las principales fuentes antropogénicas de contaminación de Hg en el medio ambiente.94 El mercurio experimenta transformaciones físicas, químicas y biológicas en el medio ambiente, siendo las principales: (a) el transporte de Hg(0) través de la atmósfera, su oxidación fotoquímica a Hg(II) y posterior deposición en los suelos, lagos, ríos y el mar; (b) la metilación de Hg(II) por acción bacteriana en hábitats anóxicos, provoca su absorción por organismos acuáticos y acumulación en la cadena alimenticia, resultando en altas concentraciones de mercurio en peces y la exposición crónica en seres humanos.95 La contaminación por Hg puede ser mucho más amplia que la observada para otros metales pesados debido a su transporte atmosférico96 o por su biomagnificación en la cadena alimentaria, alcanzando a peces y seres humanos.97 Las formas iónicas del mercurio son fuertemente adsorbidas por los suelos y sedimentos, y se desorben lentamente. La mayoría de los iones de mercurio son adsorbidos por la materia orgánica en los suelos ácidos. Cuando la materia orgánica no está presente, el mercurio se vuelve relativamente más móvil en suelos ácidos y puede evaporarse a la atmósfera o lixiviarse a aguas subterráneas.97 2.2.2. Toxicidad por mercurio El mercurio, y particularmente la forma de metilmercurio orgánico, es una neurotoxina potente capaz de perjudicar el desarrollo neurológico en fetos y niños pequeños, además de dañar el sistema nervioso central de los adultos. La exposición al mercurio inorgánico puede dañar el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso, y los riñones.98 El envenenamiento que se produce por el Hg se le denomina hidrargirismo o mercurialismo. Los síntomas de envenenamiento por mercurio son principalmente trastornos neuronales, pero también se producen daños en el sistema cardiovascular, huesos, etc.99 A niveles altos de exposición a Hg se produce cambios en la personalidad, aumento de la excitabilidad, pérdida de memoria, insomnio, etc.100 La toxicidad del mercurio depende fuertemente de su estado redox.101 La forma más tóxica del mercurio es el Hg(II) altamente reactivo, que se une al aminoácido cisteína en la proteínas. En contraste, el peligro de mercurio elemental Hg(0) y los compuestos organomercuriales radica en sus rutas de transporte.102 El vapor de mercurio es fácilmente inhalado, entra en el torrente sanguíneo, a los pulmones y por lo tanto se distribuye por todo el cuerpo. Dentro de las células, se oxida a Hg(II). La toxicidad de metilmercurio (MeHg+) o dimetilmercurio (Me2Hg) es causada por su capacidad de penetrar las membranas en pocos segundos y también por atravesar la barrera hematoencefálica.98 2.2.3. Lineamientos de exposición al mercurio La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido que los niveles mínimos de Pb en la sangre, a los cuales no se observa un efecto sobre la salud de las personas 10 μg. L-1, y en orina de 20 μg. L-1, que sobre esta base la OMS recomienda, un nivel de concentración de Hg en el aire de 1 µg. m-3 y en el agua 1 μg. L-1 anual.103 El nivel permisible de plomo en el agua potable es de 0.002 mg. L-1 según el Ministerio del Ambiente del Perú.4 3. Espectrometría de emisión óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP- OES) La espectroscopia atómica se basa en la medida de la radiación electromagnética que es absorbida o emitida por los átomos de una muestra. Estas técnicas son comúnmente usadas en el análisis de elementos traza, la muestra es descompuesta por energía térmica, dando lugar a átomos en fase gas.104 El plasma inductivamente acoplado (ICP) es un gas altamente ionizado, que contiene electrones energéticos, iones y átomos. A pesar de la alta cantidad de iones y electrones es macroscópicamente neutral. El plasma es sostenido por un suministro continuo de energía a través de una inducción electromagnética, o un acoplamiento inductivo, a un gas circundante.105 El gas usado mayormente para la generación de plasma es el argón, el cual circula por una serie de tubos concéntricos, que constituyen la antorcha. Al final de la misma se encuentra una bobina de inducción, alimentada por un generador de alta frecuencia. Las temperaturas en el ICP son muy elevadas (4.000-10.000° K) y son suficientes para disociar las combinaciones químicas estables, incluso los óxidos refractarios, eliminándose las interferencias químicas. Estos plasmas pueden estar o no en equilibrio termodinámico. En principio, es necesario iniciar la ionización del gas utilizando un medio auxiliar, la chispa Tesla que luego se mantiene por la corriente de alta frecuencia que fluye a través de la bobina de inducción. El efecto es la aparición de un campo magnético, cuyas líneas de fuerza se orientan axialmente a la bobina, e induce a los iones y electrones a moverse en órbitas circulares, creando corrientes eléctricas, que a causa del efecto Joule ocasionan un calentamiento de los gases, alcanzándose temperaturas de hasta 10.000° K, y proporcionan la continuidad del plasma.106 En el extremo de la antorcha aparece, debido a los átomos ionizados, una especie de "llama" que, se observa durante todo el proceso de ensayo. Como consecuencia de este diseño de la antorcha, las zonas axiales son relativamente frías, si se comparan con las circundantes y es, por tanto, a través de ellas por donde se inyectan las muestras dentro de la fuente de excitación y atomización, en forma de aerosol. 107 En la espectroscopia de emisión la muestra está sujeta a una temperatura lo suficientemente alta para disociar la matriz en átomos o iones, y causar su excitación electrónica por colisión. Los átomos o iones excitados pasan desde el estado excitado al estado fundamental por la colisión con otras partículas o por la radiación emitida. La diferencia energética entre los dos estados de energía y, por lo tanto, la longitud de onda de la radiación emitida, es característica para cada elemento.106 CAPÍTULO II MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales y Equipos 1.1. Reactivos Todos los reactivos usados en este trabajo fueron de grado analítico. Se utilizó policloruro de vinilo (PVC) de alto peso molecular y 2-nitrofenil-octil-eter (NPOE) de la casa Sigma-Aldrich. Además, tetrahidrofurano (THF) y ditizona (Dz) de la casa Merck. Los cuales fueron utilizados para la elaboración de la membrana del optodo. Las soluciones estándar de Pb(II), Hg(II), Ag(I), K(I), Li(I), Na(II), Ca(II), Cd(II), Co(II), Cu(II), Mg(II), Mn(II), Ni(II), Zn(II), Al(III), Fe(III) y Cr(III) de aproximadamente 1000 mg. L-1 de la casa Merck, fueron utilizadas para la preparación de las diferentes soluciones con las que se evaluó la membrana. Además, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), cianuro de potasio, ioduro de potasio, bromuro de potasio y cloruro férrico fueron adquiridos de la casa Merck. El buffer Britton-Robinson fue preparado de ácido bórico/ácido fosfórico/ácido cítrico (0.01 mol L-1 cada uno). El pH final fue ajustado por la adición de 0.2 mol L-1 de hidróxido de sodio. Agua ultrapura fue usada para la preparación de todas las soluciones. 1.2. Materiales El diodo emisor de luz-RGB (LED RGB); resistencia dependiente de la luz (LDR); reguladores de voltaje de 5V (IC-7805); condensadores cerámicos de 0.1 μF; potenciómetros de 50 kΩ; resistencias de 220, 1000 y 15000 Ω; transistor (2N2222) y placas de cobre, se utilizaron para la construcción de los circuitos electrónicos del optodo. Por otro lado, en la construcción del cuerpo del optodo se utilizó un tubo de poliamida y un sellador de silicona transparente. Todos los componentes fueron obtenidos del medio local. 1.3. Equipos El optodo construido se acoplo a un registrador de datos de alta resolución (ADC-16 Pico® Technology), a una batería recargable de 12 V y a una computadora portátil con el programa informático PicoLog Recorder. Las características espectrales fueron llevadas a cabo en un espectrofotómetro Cary- 60 UV-Vis (Agilent Technologies) y un espectrofotómetro USB4000 (Agilent Optics) fue usado para ajustar la λ emitida por la fuente de luz (LED RGB). Un pH-metro 827 (Metrohm) fue usado, después de la calibración con buffers estándar Merck, para las determinaciones de pH. Un sistema de purificación de agua EasyPure II (Barnstead) fue usado para la preparación de agua ultrapura. Además, un agitador magnético MSH- 300i (BioSan) fue utilizado para homogenizar las soluciones que estuvieron en contacto con el optodo. 2. Metodología 2.1. Diseño del optodo 2.1.1. Diseño de los circuitos electrónicos Los circuitos electrónicos, tanto la fuente de luz (Led RGB) como el detector (LDR), fueron diseñados mediante los programas: LiveWire Professional Edition y PCB wizard 4.0. 2.1.2. Diseño del modelo El modelo del optodo fue diseñado basándose en el esquema mostrado en la Fig. 6. Para lo cual el programa CorelDraw X7 fue empleado. Fig. 6 Esquema de un optodo 2.2. Construcción del optodo 2.2.1. Construcción de los circuitos electrónicos Los diseños de los circuitos electrónicos fueron impresos en una placa de cobre mediante la técnica de transferencia térmica, para lo cual se imprimió el diseño del circuito de modo invertido en un papel termotransferible, luego este se colocó cara a cara con la placa de cobre y por medio del calor de una plancha se impregnó la tinta en la placa de cobre. Seguidamente, se sumergió esta placa con una solución caliente de cloruro férrico, la cual disolvió al cobre que no estuvo cubierto con tinta. A continuación, se procedió a perforar lo orificios por los cuales entraron los componentes. Finalmente, los componentes fueron ensamblados en la placa elaborada.108 2.2.2. Construcción del cuerpo Para la construcción del cuerpo del optodo se utilizó poliamida, la cual ha sido utilizada para la construcción de otros sensores,109 debido a que es un material muy dúctil y duro, de gran resistencia a productos químicos, a deformación térmica y a la corrosión. Se empleó el diseño previamente elaborado. 2.2.3. Ensamblado y acoplamiento Las placas de los circuitos electrónicos fueron ensambladas en el cuerpo del optodo y se hicieron las conexiones con la fuente de poder, el registrador de datos y la computadora portátil, seguidamente se procedió a cerrar herméticamente el optodo. 2.2.4. Preparación de la membrana La preparación de la membrana del optodo, se realizó a partir de una mezcla de: policloruro de vinilo (matriz), 2-nitrofenil octil éter (plastificante), ditizona (cromoionóforo) y tetrahidrofurano (disolvente).110, 111 Se buscó las cantidades adecuadas de cada componente para obtener una apropiada respuesta para Hg(II) y Pb(II) en solución. Una vez preparada esta mezcla se colocó una cantidad de la misma en el optodo, y se esperó que se evapore el solvente. 2.3. Evaluación del optodo 2.3.1. Características espectrales de la membrana La membrana se colocó en un soporte de vidrio y se situó dentro de una celda de cuarzo como se muestra en la Fig. 7, a continuación, se colocó 3 mL de agua ultrapura, para luego añadir diferentes cantidades del ión metálico (Hg(II) y Pb (II)) a diferentes condiciones de pH. El espectro de absorción fue medido en cada uno de estas adiciones, lo que permitirá determinar la λ de máxima absorbancia del complejo.112 Fig. 7 Sistema de medición de absorbancia en la membrana del optodo52 2.3.2. Ajuste de la λ emitida por la fuente de luz La λ emitida por la fuente de luz (Led RGB) del optodo, fue ajustada a la λ de máxima absorbancia del complejo Dz-Hg(II) y Dz-Pb(II), mediante el detector de un espectrofotómetro. 2.3.3. Efecto del pH Se estudió el efecto del pH, con el fin de buscar el pH óptimo al cual la ditizona, que estuvo inmovilizada en la membrana de PVC, forme complejos estables con el Hg(II) y Pb(II). Para regular el pH del medio se utilizó el buffer Britton-Robinson, que estuvo compuesto de ácido fosfórico, ácido bórico, y ácido acético (0.010 mol L-1), además, mediante una solución de NaOH (0. 2 mol L-1) se ajustó el pH final del este buffer. El rango de pH de 1.0 – 7.0 fue utilizado.14, 113, 114 2.3.4. Tiempo de respuesta El tiempo de respuesta se define como el tiempo necesario para alcanzar el 95% de la señal final del optodo.29, 112, 115 Este fue evaluado usando cuatro diferentes concentraciones de Hg(II) o Pb(II) bajo condiciones experimentales. 2.3.5. Rango dinámico El rango dinámico es el rango de concentración al cual el optodo responde de forma lineal, con un R2 por encima de 0.995.10, 35, 57 Este fue estudiado mediante la adición gradual de Hg(II) o Pb(II) ) bajo condiciones experimentales. 2.3.6. Límite de detección El límite de detección (LOD) de un optodo, es definido como la concentración de analito que proporciona una señal igual al blanco más tres veces su desviación estándar.14, 116 2.3.7. Límite de saturación El límite de saturación (LOS) de un optodo, es definido como la concentración del analito a la cual la respuesta comienza a curvarse, debido a que la Dz, presente en la membrana de PVC, estuvo acomplejada completamente con el Hg(II) o Pb(II) bajo condiciones experimentales.117 2.3.8. Repetibilidad y Reproducibilidad La repetibilidad y reproducibilidad del optodo fueron avaluadas realizando 12 determinaciones con determinadas concentraciones de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales, con 12 diferentes membranas (3 días, y cada día con 4 membranas).35, 112, 118 La prueba ANOVA fue usada para evaluar si existe diferencia entre los resultados. 2.3.9. Estabilidad a corto plazo Se estudió la estabilidad a corto plazo del optodo, para lo cual se precedió a medir una determinada concentración de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales, cada 30 minutos durante un periodo de 4 horas (n=8). Se determinó si existe diferencia significativa durante este periodo.27, 115, 119 2.3.10. Selectividad La selectividad del optodo fue probada, mediante la determinación de Hg(II) o Pb(II) en presencia de otros metales interferentes Ag(I), K(I), Li(I), Na(II), Ca(II), Cd(II), Co(II), Cu(II), Mg(II), Mn(II), Ni(II), Zn(II), Al(III), Fe(III) y Cr(III). Se evaluó el error relativo que provocó la presencia de estos interferentes, el cual fue reconocido como el nivel de tolerancia del optodo.44, 56, 57 2.3.11. Tiempo de vida El tiempo de vida del optodo se evaluó durante un periodo de 96 horas. El optodo fue expuesto a diferentes condiciones ambientales. Posteriormente, se procedió a medir la respuesta a determinada concentración de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales. La respuesta obtenida se comparó con la respuesta de una membrana fresca.57, 114, 120 2.3.12. Regeneración Una vez que la membrana entró en contacto con Hg(II) o Pb(II), esta debió ser regenerada. Se probó al SCN-, Br-, I- y EDTA como reactivos regeneradores. Seguidamente, se escogió al reactivo que proporcione una mejor respuesta. Entonces, se determinó el tiempo de regeneración y cuantas veces puede ser regenerada una misma membrana.113, 115, 119 2.3.13. Comparación con un método estándar (ICP-OES) El optodo fue aplicado para determinar Hg(II) y Pb(II) en muestras reales de agua. Además, el contenido de Hg(II) y Pb(II) también fue determinado por el método estándar ICP-OES. Para comparar ambos métodos, la prueba de t-Student con un nivel de confianza del 95% fue usada.35, 112 CAPÍTULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el presente capitulo se reportarán y discutirán los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, en el cual se diseñó, construyó y evaluó un optodo basado en la inmovilización de ditizona en una membrana de PVC, que respondió a Pb(II) y Hg(II) en solución. 1. Diseño del optodo 1.1. Diseño de los circuitos electrónicos Dos componentes principales forman parte de la instrumentación de un optodo, la fuente de luz y el detector. Diversos autores han reportado el uso de diferentes tipos de fuente de luz, entre ellas los diodos emisores de luz (LEDs), debido a su simplicidad y bajo costo.112, 121-123 Además, existe un tipo de LED llamado RGB, cuya característica principal es emitir longitudes de onda de colores primarios: azul, verde y rojo, que por medio de su mezcla se puede obtener todo el espectro visible, este tipo de LED aún no ha sido reportado como fuente de luz en un optodo. Por otro lado, el uso de resistores dependientes de la luz (LDRs) como fotodetectores también han sido reportados.112, 122-124 Debido a estos antecedentes se procedió al diseño del circuito electrónico, de la fuente de luz y el detector, usando como componentes principales un LED RGB y un LDR, respectivamente. El programa informático LiveWire Professional Edition ha sido utilizado para diseñar los circuitos electrónicos, los cuales están representados en la Fig. 1.1 En cuanto a la fuente de luz, el LED RGB estuvo acompañado de un regulador de voltaje de 5 V (IC- 7805), un condensador cerámico de 0.1 μF (C1) el cual sirvió para desacoplar el circuito integrado, tres potenciómetros de 50 kΩ (P1, P2 y P3) usados para controlar la intensidad de corriente que fue hacia los terminales del LED RGB, tres resistencias de 220 Ω (R1, R2 y R3) que evitaron que la intensidad de corriente exceda la capacidad del LED RGB. Por otro lado, el detector (LDR) está acompañado de un transistor (2N2222) cuya finalidad fue la amplificación lineal y la conmutación del circuito, un condensador cerámico de 0.1 μF (C2) con la misma función antes mencionada, un LED secundario donde se midió el cambio de voltaje, tres resistencias de 15000, 1000 y 220 Ω (R4, R5 y R6) que sirvieron para controlar la intensidad de corriente que fue hacia los demás componentes. IC 7805 1 3 VI VO P3 (-) GND 1S 1E R3 2 C1 P2 1S 1E R2 LED RGB 1 2 3 P1 4 1S 1E R1 (+) GND a R6 LED (+) 2N2222 C2 GND (-) LDR R4 R5 b Fig. 1.1 Diseño de los circuitos electrónicos. a) Fuente de luz, b) Detector Los diseños de los circuitos electrónicos fueron exportados al programa informático PCB wizard 4.0, con el fin de obtener los diseños de los circuitos impresos, los cuales se muestran en la Fig. 1.2. Estos se utilizaron para elaborar las placas electrónicas de la fuente de luz y el detector. Fig. 1.2 Diseño de los circuitos impresos. a) Fuente de luz, b) Detector 1.2. Diseño del modelo Existen diversos autores que han desarrollado diferentes modelos de optodos.125-128 Teniendo en cuenta estos modelos se hizo un diseño del optodo, el cual se muestra en la Fig. 1.3, donde la distribución de los componentes se realizó de forma adecuada para su correcto funcionamiento. La fuente de luz se colocó en la parte superior con sus respectivos orificios para la salida de los potenciómetros y el LED RGB, seguidamente se colocó un puerto de acceso de la muestra y en la parte inferior se colocó el detector con orificios para la salida del LED secundario y el LDR. Tanto, el LED RGB y el LDR se colocaron uno en frente del otro. La membrana del optodo se ubicó en un soporte de vidrio que está por encima de del LDR. Todos los cables conectores salieron por un orificio de la parte superior. Este diseño se realizó mediante el programa informático CorelDraw X7. a1 a2 b c d1 d2 Fig. 1.3 Diseño del modelo de optodo. a) Fuente de luz: a1 Potenciómetros, a2 LED RGB; b) Puerto de acceso de la muestra; c) Membrana; d) Detector: d1 LDR, d2 LED secundario. 2. Construcción del optodo 2.1. Construcción de los circuitos electrónicos Una de las técnicas más usadas en el ámbito electrónico a microescala, para la construcción de circuitos electrónicos, es la transferencia térmica,108 La ejecución de esta técnica se realizó mediante la impresión de los diseños de los circuitos impresos (Fig. 1.2) en un papel termo-transferible (PTT), usando una impresora láser (usa tóner). Seguidamente, se cortó unas placas de cobre a la medida de los circuitos impresos y fueron lavadas. Luego, se colocó el PTT impreso sobre las placas de cobre y por encima una hoja de papel bond. A continuación, se usó una plancha eléctrica a temperatura máxima para adherir el PTT a la placa de cobre, se dejó enfriar y se sumergió la misma en agua fría durante cinco minutos. Inmediatamente, se retiró suavemente el PTT de la placa de cobre. Una vez que estos diseños de los circuitos impresos estuvieron adheridos a las placas de cobre, estas fueron colocadas en un recipiente con cloruro férrico 40% p/v. La reacción que se produjo fue: 2FeCl3 + Cu ⇋ 2FeCl2 + CuCl2 (1) Donde el cloruro férrico permitió oxidar solo al cobre metálico que no estuvo cubierto por el tóner, este tóner está compuesto de polímeros y óxido de hierro por lo cual no fue oxidado por el cloruro férrico, protegiendo al cobre metálico que había cubierto. El cloruro de cobre (II) que se forma presenta una alta solubilidad en agua, debido a esto se desprende fácilmente de la placa. Una vez, que todo el cobre sobrante fue retirado, se sacaron las placas del recipiente y se retiró el tóner con acetona. Luego, se perforó los orificios por los cuales ingresaron las terminales de los componentes. Finalmente, se ensamblaron todos los componentes en las placas elaboradas. En la Fig. 2.1 se muestran los circuitos electrónicos finalizados. Fig. 2.1 Circuitos electrónicos. a) Fuente de Luz, b) Detector 2.2. Construcción del cuerpo Existen antecedentes de trabajos realizados, donde se usó a la poliamida (nylon) para la elaboración del cuerpo de diferentes dispositivos,109, 129 debido a que, es un material muy dúctil y duro; químicamente inerte; de gran resistencia a productos químicos, a deformación térmica y a la corrosión.130 Tomando en cuenta esta información, se construyó el cuerpo del optodo usando como material un tubo de poliamida, este material fue moldeado mediante un torno y un taladro, para lo cual se usó el diseño de modelo del optodo realizado previamente (Fig. 1.3). El cuerpo del optodo construido mostró un buen acabado superficial. Este se muestra en la Fig. 2.2. Fig. 2.2 Cuerpo del optodo. a) Cara externa, b) Cuerpo del optodo armado, c) Cara interna 2.3. Ensamblado y acoplamiento Con los circuitos electrónicos y el cuerpo del optodo ya construidos, se procedió al ensamblaje. Para lo cual se hicieron las conexiones del dispositivo, luego se colocó los circuitos electrónicos en su posición dentro del cuerpo del optodo, los cables conectores fueron sacados por un orificio ubicado en la parte superior del mismo y unos soportes de vidrio fueron puestos por encima de la salida del LED RGB y el LDR. Finalmente, el optodo fue cerrado herméticamente usando silicona acética. Este pegamento ha sido usado para sellar otros dispositivos,112, 123 debido a sus características como: estabilidad a temperaturas altas, gran adherencia, impermeabilidad e inercia química.131 Una batería recargable de 12V fue utilizada como fuente de energía para el optodo. Por otro lado, este fue acoplado a un registrador de datos de alta resolución (ADC-16 Pico® Technology), para lo cual, se estableció una conexión entre las terminales del diodo secundario y los canales 1 y 5 del registrador de datos, que a su vez fue conectado a través de su puerto serial RS-232, mediante un cable convertidor USB, a una computadora portátil. Este registrador de datos se usó junto al programa informático PicoLog Recorder, ambos permitieron reconocer, registrar y visualizar los cambios de voltaje (mV) producidos por el optodo en el proceso de determinación del Hg(II) y Pb(II). El dispositivo ensamblado y acoplado se muestra en la Fig. 2.3. En la mayoría de investigaciones que han sido reportadas, el acoplamiento del optodo fue con un espectrofotómetro,20, 115, 132 un amplificador de señal133 y otros se conectaron directamente con el programa informático de la computadora121, 134. Aún no se han reportado optodos acoplados a registradores de datos, como el que es mostrado en la presente investigación. Fig. 2.3 Optodo acoplado. a) Registrador de datos, b) Computadora portátil, c) Optodo, d) Batería 2.4. Preparación de la membrana La preparación de la membrana fue realizada de acuerdo a los métodos empleados en investigaciones previamente reportadas para diferentes metales. En las cuales usaron como componentes de la membrana al policloruro de vinilo (matriz), 2- nitrofenil octil éter (plastificante), ditizona (cromoionóforo) y tetrahidrofurano (disolvente).110, 111, 135-137 Se probó diferentes cantidades de los componentes antes mencionados. La mezcla que obtuvo una mejor apariencia fue: 10 mg de policloruro de vinilo, 20 μL de 2-nitrofenil octil éter y 2.25 mg de ditizona, los cuales fueron colocados en un tubo de vidrio sumergido en un baño de hielo. Esta mezcla fue homogenizada mediante un agitador magnético durante 1 minuto, luego fue disuelta en 250 μL de tetrahidrofurano y homogenizada durante 10 minutos. Entonces, 20 μL de esta mezcla fue depositada sobre el soporte de vidrio del dispositivo construido. Después de 10-15 minutos, el disolvente fue evaporado al ambiente, a una temperatura aproximada de 25 oC. En la Fig. 2.4 se muestra la membrana que fue preparada. Fig. 2.4 Membrana del optodo 3. Evaluación del optodo 3.1. Características espectrales de la membrana La membrana se colocó en un soporte de vidrio, el cual fue situado en una celda de cuarzo. Luego se añadió 3 mL de agua ultrapura (blanco) a determinado pH (2.0 y 5.0). Para determinar el espectro de absorción se utilizó un espectrofotómetro Cary 60 UV- VIS (Agilent Technologies). Seguidamente, se agregó diferentes cantidades de Hg(II) o Pb(II) a diferentes condiciones de pH de 2.0 y 5.0, respectivamente, cada ion metálico de forma separada. El espectro de absorción de la ditizona inmovilizada en la membrana de PVC, mostró dos longitudes de onda de máxima absorbancia a 440 y 590 nm, tanto para pH 2.0 y 5.0. La aparición de estas dos λ se debió a que la Dz presenta dos formas tautoméricas en solución, donde las λ de 440 y 590 nm corresponden a la forma enol y ceto, respectivamente.138, 139 Como se muestra en la Fig. 3.1 y Fig. 3.2, la formación de los complejos de Dz con Hg(II) y Pb(II) provocó una disminución de la absorbancia a 440 nm, con el aumento de la concentración de ambos metales de forma proporcional. Sin embargo, a 590 nm no se mostró una disminución de la absorbancia proporcional con estos iones metálicos. Un comportamiento similar ha sido observado en los complejos de Dz con Hg(II) y Pb(II) en otros tipos de membranas de optodos.60, 140 Fig. 3.1 Espectro de absorción de la membrana de Dz en respuesta a Hg(II) en el rango de 0.1–5 μg. mL-1 a pH 2. (A-Z muestra el incremento de la concentración de Hg(II)) Fig. 3.2 Espectro de absorción de la membrana de Dz en respuesta a Pb(II) en el rango de 0.1–5 μg. mL-1 a pH 5. (A-Z muestra el incremento de la concentración de Pb(II)) 3.2. Longitud de onda emitida por la fuente de luz El LED RGB trabaja con el sistema RGB, el cual consiste en la mezcla aditiva de los tres colores primarios (rojo, verde y azul), que pueden generar un amplio rango de colores.66 Teniendo en cuenta la λ de máxima absorbancia del complejo Dz-Hg(II) y Dz-Pb(II), la cual fue de 440 nm, se buscó la λ que emitió la fuente de luz (LED RGB). Para lo cual, la fuente de luz del optodo se conectó al detector de un espectrofotómetro USB4000 (Ocean Optics). Entonces, mediante los potenciómetros de la fuente de luz se intentó ajustar la λ a 440 nm, pero como se muestra en la Fig. 3.3 no se produjo una mezcla de los colores. Esto podría ser debido a que el LED RGB presenta un sistema diferenciado para cada color, que no permite su adición adecuada a lo largo de su trayecto, por lo que cada color fue captado de forma aislada por el detector. Debido a esta limitación del LED RGB, se utilizó la λ más cercana que fue de 460 nm. Además, la intensidad de luz que llegó al detector en presencia de la membrana fue regulada, con el fin de obtener una repuesta inicial de aproximadamente 1000 mV. La Fig. 3.3 muestra el espectro de emisión del LED RGB, se observan dos picos que representan a la luz azul (460 nm) y la luz roja (630 nm), de forma aislada. Se han reportado estudios similares en los que usan espectrofotómetros para medir la λ que emite un LED.141, 142 Fig. 3.3 Espectro de emisión de la fuente de luz. a) Luz azul (460 nm), b) Luz roja (630 nm) 3.3. Procedimiento y principio de medición Una vez que la membrana fue colocada en el soporte de vidrio del optodo y la fuente de luz fue ajustada. El optodo fue introducido en un contenedor con agua ultrapura (blanco), la cual fue ajustada a un pH determinado con el buffer Britton-Robinson 0.010 mol L-1, este sistema se mantuvo en agitación constante. Se ejecutó el programa informático PicoLog Recorder, el optodo fue encendido y se verificó que la respuesta para el blanco estuviera adecuadamente ajustada a 1000 mV. A continuación, se agregó determinadas cantidades de los iones metálicos en investigación y se midió el cambio de voltaje a un tiempo dado. El contenido de Hg(II) o Pb(II) en la muestra fue entonces calculado a partir de la comparación de estos dos valores obtenidos. Todas las mediciones fueron llevadas a cabo por triplicado. El principio de medición del optodo presentado en esta investigación, se basa en la preconcentración del analito en un sustrato sólido (membrana) que produce un cambio en una propiedad óptica del sustrato sólido que es proporcional a la concentración de analito.31 Cuando el Hg(II) o Pb(II) estuvieron en contacto con la membrana de Dz, provocaron un cambio en la absorbancia, la cual fue disminuyendo proporcionalmente con el aumento de la concentración de estos iones metálicos. Entonces, la disminución de la absorción de la membrana del optodo condujo a un aumento de la intensidad de luz.38 Este cambio en la intensidad de luz es reconocido por el detector (LDR), a mayor intensidad de luz recibida por el detector, su resistencia fue mayor. El detector estuvo conectado a un LED secundario. Por lo tanto, cuando la resistencia aumento, la intensidad de corriente y el voltaje relacionados con el LED secundario disminuyeron. Este cambio en el voltaje fue reconocido por el registrador de datos y el programa informático. En síntesis, en el optodo propuesto la concentración de Hg(II) o Pb(II) fue inversamente proporcional al voltaje. Existen investigaciones donde el principio de medición de sus optodos fue similar al expuesto en este trabajo. La diferencia con estas investigaciones es que usaron al detector (LDR) en un circuito diferente, en el cual al recibir mayor intensidad de luz su resistencia disminuía.112, 122, 123 Por el contrario, en la presente investigación, cuando el detector (LDR) recibió mayor intensidad de luz la resistencia aumento. Esto es debido, a que en el circuito se colocó al LDR en paralelo con la tensión base-emisor del transistor (Fig. 1.1), lo que produjo este efecto inverso.71 3.4. Efecto del pH Las características de respuesta del optodo tales como sensibilidad, selectividad, rango dinámico, tiempo de respuesta y límite de detección dependen del pH.143, 144 Además, la Dz forma complejos estables con diferentes iones metálicos a diferentes condiciones de pH.11 El efecto del pH fue estudiado evaluando la respuesta del optodo a 1 μg. mL-1 de Hg(II) o Pb(II), usando buffer Britton-Robinson en un rango de pH de 1-7. Se estableció este rango de pH, debido a que la Dz es insoluble en soluciones acuosas a pH<7.55 La influencia del pH sobre la respuesta del optodo propuesto es ilustrada en las Fig. 3.4 y 3.5, para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. Como se muestra en la Fig. 3.4, mientras el pH de la solución fue aumentando, la respuesta del optodo fue decreciendo. El optodo respondió de manera constante a valores de pH<2 para el Hg(II) en solución. Probablemente debido, a que la protonación de los átomos de nitrógeno y sulfuro de la Dz, especialmente estos últimos forman grupos tiol con los que el Hg(II) es muy afín.145 Por lo tanto, el pH 2 fue seleccionado para los siguientes estudios. Otras investigaciones, las cuales usaron a la Dz como cromoionóforo en la membrana de un optodo, reportaron un resultado similar, estableciendo que el pH extremadamente acido favorece la formación del complejo de Hg(II).14, 140 En la Fig. 3.5 se muestra, que la respuesta del optodo fue aumentado proporcionalmente con el incremento del pH de la solución, hasta el pH 5, donde por encima de este comenzó a decaer de nuevo, para el Pb(II) en solución. Posiblemente debido, a la protonación de los átomos de nitrógeno y sulfuro, que podría haber reducido las interacciones donador-aceptor entre la Dz y el Pb(II). Además, la reducción de la respuesta del optodo a pH>5, probablemente fue causada por el comienzo en la formación de complejos hidroxilo del Pb(II).146 Entonces, en los experimentos subsecuentes, el pH 5 fue usado para la determinación de Pb(II) en solución. Por otro lado, investigaciones reportadas, donde se usaron a la Dz, muestran un resultado análogo, estableciendo que el pH 5 favorece la formación del complejo de Pb(II).140, 147 Fig. 3.4 Efecto del pH sobre la respuesta del optodo propuesto en presencia de 1 μg. mL-1 de Hg(II) Fig. 3.5 Efecto del pH sobre la respuesta del optodo propuesto en presencia de 1 μg. mL-1 de Pb(II) 3.5. Tiempo de respuesta Una característica analítica importante de un optodo es su tiempo de respuesta. El cual se define como el tiempo necesario para alcanzar el 95% de la señal final del optodo.119 Este depende del espesor de la membrana, la composición de membrana, la actividad del analito y el pH.148 Las Fig. 3.6 y 3.7 muestran el tiempo de respuesta del optodo propuesto, utilizando diferentes concentraciones de Hg(II) o Pb(II) en solución. En este trabajo, el optodo alcanzó el 95% de la señal final a 10-13 y 9-13 minutos, para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. Este rango de tiempo dependió de la concentración de estos iones metálicos. A altas concentraciones de estos iones metálicos, se dio una respuesta más rápida del optodo. A bajas concentraciones un mayor tiempo de respuesta ha sido producido por el optodo. Esto es debido al hecho de que el tiempo de respuesta de la membrana del optodo está regida por tres procesos: (1) La difusión en la membrana (2) La velocidad de formación de complejos entre los iones metálicos y la Dz y (3) La velocidad de disociación complejo.149 Fig. 3.6 Tiempo de respuesta del optodo propuesto a diferentes concentraciones de Hg(II) a pH 2 Fig. 3.7 Tiempo de respuesta del optodo propuesto a diferentes concentraciones de Pb(II) a pH 5 3.6. Rango dinámico El rango dinámico se define como el rango de concentraciones que con precisión puede ser cuantificado.150 Por lo tanto, al cual el optodo responde de forma lineal, con un R2 por encima de 0.995.151 Las Fig. 3.8 y 3.9 muestran las señales de voltaje del optodo a varias concentraciones en un rango de 0-4.0 μg. mL-1 para ambos iones metálicos en investigación. Como puede verse, el gráfico del voltaje (mV) frente a la concentración de Hg(II) o Pb(II) (μg. mL-1), exhibe un rango lineal entre 0.10-3.25 μg. mL-1 (5.0×10−7–1.6×10−5 mol L-1) y 0.08-3.50 μg. mL-1 (3.6×10−7-1.7x10−5 mol L-1), para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. La ecuación de regresión: para el Hg(II) fue y = -115.44 x + 1021.1 (R2 = 0.9959) y para el Pb(II) fue y = -112.90 x + 1017.8 (R2 = 0.9951). Como se muestra en la Tabla 1, el rango dinámico del optodo propuesto es apropiado en comparación con otros optodos. 3.7. Límite de detección El límite de detección (LOD) de un optodo, es definido como el nivel más bajo de concentración del analito que pude ser determinado y que es estadísticamente diferente a un blanco analítico.152 Este puede ser calculado encontrando la concentración del analito que proporciona una señal igual al blanco y añadiendo tres veces su desviación estándar.14, 116 Los LOD encontrados fueron 0.018 μg. mL-1 (9.0x10-8 mol L-1) y 0.012 μg. mL-1 (6.0x10-8 mol L-1) para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. El límite de detección obtenido se encontró a un nivel adecuado, en comparación con otros optodos reportados, como se resume en la Tabla 1. 3.8. Límite de saturación El límite de saturación (LOS) de un optodo, se refiere a la concentración del analito a la cual la respuesta comienza a curvarse, debido a que la Dz, presente en la membrana de PVC, esta acomplejada completamente con el Hg(II) o Pb(II).60 El LOS hallado para Hg(II) fue de 3.50 μg. mL-1 (1.7x10-5 mol L-1) y para Pb(II) fue 3.75 μg. mL-1 (1.8x10-5 mol L-1). Se han reportado investigaciones donde el LOS se encuentra en un rango de 1.0x10-5-1.0x10-4.14, 27, 153 El LOS encontrado para cada ion metálico en la presente investigación se encuentra dentro de este rango. Fig. 3.8 La respuesta del optodo vs concentraciones de Hg(II) en el rango de 0-4.0 μg. mL-1 a pH 2 Fig. 3.9 La respuesta del optodo vs concentraciones de Pb(II) en el rango de 0-4.0 μg. mL-1 a pH 5 Tabla 1. Comparación de las características de rendimiento de optodos reportados recientemente con el optodo propuesto para la determinación de Hg(II) y Pb(II) Ion metálico T. Rpta. Rango Dinámico LOD Ionóforo Ref. determinado (min) (mol L-1) (mol L-1) Tiazolina Hg(II) 10 2.0×10−10–1.5×10−5 5.0×10−11 (148) Tritil-picolinamida Hg(II) 5-10 5.0×10−7–5.0×10−4 5.0×10−7 (34) Índigo de carmín Hg(II) 8-10 2.4×10−5–4.7× 10−4 7.2×10−6 (154) Ditizona Hg(II) 3-9.3 7.5×10−7–9.7×10−6 1.0×10−7 (14) Ditizona Hg(II) 25 1.1×10−8–2.0×10−6 2.0×10−9 (140) Ditizona Hg(II) 10-13 5.0×10−7–1.6×10−5 9.0×10−8 Este trabajo Galocianina Pb(II) 1 4.8×10−7–4.8×10−3 3.6×10−7 (155) Arsenazo III Pb(II) 3 9.6×10−7–1.0×10−5 4.8×10−8 (143) Difenilcarbazona Pb(II) 1.5-3 6.9×10−6–1.1×10−2 6.5×10−6 (35) Ditizona Pb(II) 11-15 2.4×10−6–2.6×10−5 7.2×10−7 (147) Ditizona Pb(II) 28 1.2×10−8–2.4×10−6 4.0×10−9 (140) Ditizona Pb(II) 9-13 3.6×10−7-1.7x10−5 6.0×10−8 Este trabajo 3.9. Repetibilidad y Reproducibilidad La repetibilidad y reproducibilidad del optodo fueron evaluadas realizando 12 determinaciones con 1 ug. mL-1 de Hg(II) o Pb(II) con 12 diferentes membranas del optodo (3 días, y cada día con 4 membranas). La prueba de ANOVA fue usada para evaluar si existe diferencia entre los resultados. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 2-5. Estos mostraron que el Fcrit en común para las membranas preparadas en diferentes días fue 4.26 y los Fcal fueron 0.43 y 0.66, para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. Además, los Fcrit en común para las membranas preparadas el mismo día fue 4.26 y los Fcal fueron 1.69 y 1.10, correspondientemente para Hg(II) y Pb(II). Por lo tanto, la prueba ANOVA mostró que no existe diferencia significativa entre las membranas preparadas en diferentes días y el mismo día. Entonces, podemos afirmar que el optodo propuesto tuvo una repetibilidad y reproducibilidad adecuadas. Tabla 2. Prueba de ANOVA para membranas del optodo preparadas diferentes días en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 1.29 2 0.65 0.43 0.66 4.26 Dentro de los 13.48 9 1.50 grupos Total 14.77 11 Tabla 3. Prueba de ANOVA para membranas del optodo preparadas el mismo día en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 0.42 2 0.21 1.69 0.24 4.26 Dentro de los 1.12 9 0.12 grupos Total 1.54 11 Tabla 4. Prueba de ANOVA para membranas del optodo preparadas diferentes días en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 1.14 2 0.57 0.66 0.54 4.26 Dentro de los 7.78 9 0.86 grupos Total 8.93 11 Tabla 5. Prueba de ANOVA para membranas del optodo preparadas el mismo día en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 1.75 2 0.88 1.10 0.37 4.26 Dentro de los 7.15 9 0.79 grupos Total 8.90 11 3.10. Estabilidad a corto plazo La estabilidad a corto plazo del optodo fue estudiada, para lo cual se precedió a medir la respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales, cada 30 minutos durante un periodo de 4 horas (n=8). La prueba de ANOVA fue usada para evaluar si existe diferencia entre cada tiempo. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 6-9. La prueba de ANOVA mostró que existe diferencia significativa entre los distintos tiempos, en respuesta a ambos iones metálicos en estudio. Debido a esto, se realizó la prueba LSD que indicó que hasta las 2 horas el optodo es estable, tanto en respuesta al Hg(II) como al Pb(II). Según investigaciones reportadas, los optodos cuyas membranas usaron como matriz al PVC muestran una estabilidad a corto plazo de 2-5 horas.27, 115, 118. Además, la inestabilidad mostrada por encima de las dos horas podría deberse a que el complejo Dz-ion metálico se está degradando, posiblemente por la luz.156 Tabla 6. Prueba de ANOVA para diferentes tiempos en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) del optodo propuesto Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 13.96 7 1.99 18.63 1.40x10-6 2.66 Dentro de los 1.71 16 0.11 grupos Total 15.67 23 Tabla 7. Prueba de LSD para los diferentes tiempos en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) del optodo propuesto Grupos Tiempo Cuenta Promedio homogéneos 30 3 908.13 X 60 3 908.16 X 90 3 908.40 X 120 3 908.51 X 150 3 909.13 X 180 3 909.60 X 210 3 909.68 X 240 3 910.33 X Tabla 8. Prueba de ANOVA para diferentes tiempos en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) del optodo propuesto Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 9.86 7.00 1.41 45.68 2.12x10-9 2.66 Dentro de los 0.49 16.00 0.03 grupos Total 15.67 23 Tabla 9. Prueba de LSD para los diferentes tiempos en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) del optodo propuesto Grupos Tiempo Cuenta Promedio homogéneos 30 3 905.52 X 60 3 905.56 X 90 3 905.67 X 120 3 905.73 X 150 3 906.50 X 180 3 906.67 X 210 3 907.01 X 240 3 907.20 X 3.11. Tiempo de vida El tiempo de vida del optodo fue probado sobre un periodo de 96 horas. En el cual, el optodo fue expuesto a diferentes condiciones ambientales: luz-aire, oscuridad-aire, luz-agua y oscuridad-agua. Posteriormente, se precedió a medir la respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales. La prueba de ANOVA fue usada para evaluar si existió diferencia significativa entre el optodo expuesto a diferentes condiciones ambientales y el optodo cuando uso una membrana fresca. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 10-13. La prueba de ANOVA mostró que el Fcrit en común fue 3.48 y los Fcal fueron 34.31 y 39.44, para Hg(II) y Pb(II), respetivamente. Por lo tanto, se encontró que existe diferencia significativa entre las distintas condiciones ambientales a las que se expuso el optodo. Por consiguiente, se realizó la prueba LSD que indicó que el optodo cuando estuvo expuesto a la luz sufrió un cambio estadísticamente significativo en su respuesta al Hg(II) y al Pb(II). Esto posiblemente se debe a que la ditizona, que estuvo inmovilizada en la membrana de PVC, sufrió una alteración al estar expuesta a la luz de forma prolongada. Existen investigaciones que reportan que la ditizona al estar expuesta a la luz es oxidada formando el compuesto difeniltiocarbodiazona, que no reacciona con lo iones metálicos.156, 157 Tabla 10. Prueba de ANOVA para diferentes condiciones ambientales en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) del optodo propuesto Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 13.82 4 3.45 34.31 8.17x10-6 3.48 Dentro de los 1.01 10 0.10 grupos Total 14.82 14 Tabla 11. Prueba de LSD para diferentes condiciones ambientales en respuesta a 1 ug. mL-1 de Hg(II) del optodo propuesto Condiciones Grupos Cuenta Promedio ambientales homogéneos Fresco 3 908.47 X Oscuridad-Aire 3 908.41 X Oscuridad-Agua 3 908.62 X Luz-Aire 3 910.37 X Luz-Agua 3 910.54 X Tabla 12. Prueba de ANOVA para diferentes condiciones ambientales en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) del optodo propuesto Origen de las Suma de Grados de Promedio Valor crítico F Prob. variaciones cuadrados libertad cuadrados para F Entre grupos 15.78 4 3.94 39.44 4.29x10-6 3.48 Dentro de los 1.00 10 0.10 grupos Total 16.78 14 Tabla 13. Prueba de LSD para diferentes condiciones ambientales en respuesta a 1 ug. mL-1 de Pb(II) del optodo propuesto Condiciones Grupos Cuenta Promedio ambientales homogéneos Fresco 3 905.56 X Oscuridad-Aire 3 905.50 X Oscuridad-Agua 3 905.37 X Luz-Aire 3 907.61 X Luz-Agua 3 907.52 X 3.12. Regeneración La regeneración es una característica importante para un optodo. Una vez que el optodo fue expuesto a 2 ug. mL-1 de Hg(II) o Pb(II), su señal cambio. Por lo tanto, se usó diferentes reactivos para recuperar la señal del optodo a su estado inicial. Reactivos como SCN-, Br-, I- y EDTA fueron estudiados como agentes regeneradores. Entonces, se encontró que el SCN-, Br- y EDTA no dieron resultados adecuados para este estudio, donde el mejor resultado se obtuvo mediante la aplicación de I-. El cual dio un tiempo de regeneración del optodo entre 18-20 min y 17-20 min, para Hg(II) y Pb(II), respectivamente. Seguidamente, se procedió a poner en contacto el optodo regenerado con 2 ug. mL-1 de Hg(II) o Pb(II), bajo condiciones experimentales, donde se observó que la respuesta fue similar a la de un optodo que tuvo una membrana recién preparada para ambos casos. Después de una segunda regeneración del optodo, la señal inicial del optodo alcanzó un 87.4% y 91.7% (para Hg(II) y Pb(II), respectivamente), en comparación con la de un optodo que tuvo una membrana recién preparada. Por lo tanto, el optodo solo pudo ser regenerado de manera adecuada una vez. Las Fig. 3.10 y 3.11 muestran la respuesta del optodo a 2 μg. mL-1 de Hg(II) o Pb(II) y seguidamente el proceso de regeneración aplicando al I-. Diferentes estudios reportados demuestran que la regeneración de optodos usando al I- ha sido factible,14, 158 como es reafirmado en la presente investigación. Probablemente, esto se debe a que el I- presenta constantes de formación de complejos con Hg(II) y Pb(II) relativamente altas159, y un tamaño menor que el EDTA, lo que podría facilitar la extracción de estos iones metálicos que fueron concentrados en la membrana del optodo. Fig. 3.10 Respuesta del optodo a 2 μg. mL-1 de Hg(II) a pH 2 y regeneración con 0.01 mol L-1 I-. Fig. 3.11 Respuesta del optodo a 2 μg. mL-1 de Pb(II) a pH 5 y regeneración con 0.01 mol L-1 I-. 3.13. Selectividad La selectividad del optodo, que refleja la respuesta relativa del optodo hacia el analito en presencia de posibles interferentes, es quizá la característica más importante de un optodo. La selectividad del optodo fue probada, mediante la determinación de 1 μg. mL-1 de Hg(II) o Pb(II) en presencia de otros iones metálicos interferentes, los cuales fueron Ag(I), K(I), Li(I), Na(II), Ca(II), Cd(II), Co(II), Cu(II), Mg(II), Mn(II), Ni(II), Zn(II), Al(III), Fe(III) y Cr(III) a una concentración de 3 μg. mL-1. Se definió al error relativo como: ER% = [(V − V0)/V0] ∗ 100 (2) Donde V0 corresponde al rango de voltaje registrado en respuesta al Hg(II) o Pb(II) y V es el rango voltaje registrado al añadir los iones metálicos interferentes. Los resultados de los estudios de selectividad se resumen en la Fig. 3.12 y 3.13. Los errores relativos de los iones interferentes inferiores a 6 y 5% (para Hg(II) y Pb(II), respectivamente), son reconocidos como los niveles tolerancia del optodo. Distintos estudios sobre optodos reportan niveles de tolerancia entre 5 y 6%.28, 44, 56, 57 Por lo tanto, el optodo propuesto exhibió una buena selectividad hacia el Hg(II) y Pb(II) con respecto a otros iones metálicos interferentes haciendo que el uso optodo sea factible para aplicaciones prácticas. Fig. 3.12 Efecto de los iones metálicos interferentes (3 μg. mL-1) sobre la determinación de Hg(II) (1 μg. mL-1) usando el optodo propuesto a pH 2 Fig. 3.13 Efecto de los iones metálicos interferentes (3 μg. mL-1) sobre la determinación de Pb(II) (1 μg. mL-1) usando el optodo propuesto a pH 5 3.14. Comparación con un método estándar (ICP-OES) Se evaluó la capacidad del optodo propuesto para determinar Hg(II) y Pb(II) en una muestra real. La concentración de estos iones metálicos fue medida en agua de grifo. Las muestras fueron recolectadas usando una técnica usual, se conservaron por acidificación con HNO3 y se almacenaron en frascos de polietileno. Cada muestra fue analizada por triplicado usando el optodo propuesto y la espectrometría de emisión óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP-OES) como método estándar. Los resultados son mostrados en las Tablas 14 y 15. Se empleó la prueba t-Student para evaluar los resultados obtenidos. Esta prueba demostró que no existe diferencia estadísticamente significativa entre ambos métodos. Existen investigaciones previas donde se reportó la comparación de diferentes optodos con métodos estándar, en las cuales no hubo diferencia significativa entre ambos métodos.113, 160, 161 Al igual que en estas investigaciones, el optodo propuesto en el presente trabajo muestra que puede ser aplicado satisfactoriamente para la determinación de Hg(II) y Pb(II) en muestras de agua. Tabla 14. Comparación del optodo propuesto y el método estándar ICP-OES en la determinación de Hg(II) en muestras de agua Hg(II) añadido Hg(II) encontrado Prueba t Muestra (μg. mL-1) Optodo propuesto ICP-OES (t0.05,4 = 2.78) - < límite de detección < límite de detección - Agua de 0.1000 0.1050±0.0016 0.1030±0.0007 2.01 grifo 0.5000 0.5036±0.0015 0.5012±0.0009 2.37 1.0000 1.0052±0.0024 1.0016±0.0010 2.40 Tabla 15. Comparación del optodo propuesto y el método estándar ICP-OES en la determinación de Pb(II) en muestras de agua Pb(II) añadido Pb(II) encontrado Prueba t Muestra (μg. mL-1) Optodo propuesto ICP-OES (t0.05,4 = 2.78) - < límite de detección < límite de detección - Agua de 0.1000 0.1050±0.0025 0.1022±0.0004 2.14 grifo 0.5000 0.5043±0.0023 0.5011±0.0005 2.31 1.0000 1.0048±0.0015 1.0028±0.0013 1.59 CONCLUSIONES  Se diseñó y construyó el optodo basado en la inmovilización de ditizona en una membrana de PVC, cuya instrumentación fue económicamente viable y estuvo constituida por una fuente de luz (LED RGB) y un detector (LDR), que a su vez estuvo acoplado a un registrador de datos de alta resolución.  El optodo dio una respuesta analíticamente aceptable para la determinación de Hg(II) y Pb(II) en solución. Este presentó un rango dinámico lineal y un límite de detección adecuados; un tiempo de respuesta relativamente rápido; una respuesta reproducible y una repetibilidad apropiada; una estabilidad a corto plazo aceptable; un tiempo de vida prolongado en la oscuridad; una buena selectividad para Hg(II) y Pb(II), dependiendo del pH y logró ser regenerado.  No existe diferencia significativa para la determinación de Hg(II) y Pb(II) en muestras de agua con el optodo propuesto en comparación con el método estándar (ICP-OES). SUGERENCIAS  Probar el mismo dispositivo con otras interfaces sensibles para la determinación de distintos contaminantes.  Establecer la factibilidad de la producción del optodo a nivel comercial.  Experimentar la aplicación práctica del optodo propuesto, en el monitoreo medio ambiental. BIBLIOGRAFÍA 1. Zhu Y, Zheng Y, Wang W, Wang A. Highly efficient adsorption of Hg (II) and Pb (II) onto chitosan-based granular adsorbent containing thiourea groups. 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