1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES ESCUELA DE POSGRADO TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGISTER EN CIENCIAS CON MENCIÓN EN: BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CULTIVABLES Y NO CULTIVABLES PROCEDENTES DE LA SANGRE Y TRACTO DIGESTIVO DE REPRODCUTORES DE CONCHA NEGRA Anadara tuberculosa KRIZIA MARIBEL PRETELL MONZÓN TUMBES, PERÚ 2016 i i 2 i i3i UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES ESCUELA DE POSGRADO TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGISTER EN CIENCIAS CON MENCIÓN EN: BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR Identificación de bacterias cultivables y no cultivables procedentes de la sangre y tracto digestivo de reproductores de concha negra Anadara tuberculosa KRIZIA MARIBEL PRETELL MONZÓN TUMBES, PERÚ 2016 i v4 DECLARACIÓN DE ORIGINALIDAD Yo Krizia Maribel Pretell Monzón declaro que los resultados reportados en esta tesis, son producto de mi trabajo con el apoyo permitido de terceros en cuanto a su concepción y análisis. Asimismo, declaro que hasta donde yo sé no contiene material previamente publicado o escrito por otra persona excepto donde se reconoce como tal a través de citas y con propósitos exclusivos de ilustración o comparación. En este sentido, afirmo que cualquier información presentada sin citar a un tercero es de mi propia autoría. Declaro, finalmente, que la redacción de esta tesis es producto de mi propio trabajo con la dirección y apoyo de mis asesores de tesis y mi jurado calificador, en cuanto a la concepción y al estilo de la presentación o a la expresión escrita. ______________________________________________________ Krizia Maribel Pretell Monzón v 5 6 vi RESPONSABLES Krizia Maribel Pretell Monzón __________________ EJECUTOR Benoit Mathieu Diringer Challe __________________ ASESOR v7i i JURADO DICTAMINADO .......................................................................... Dra. Enedia Vieyra Peña. Presidenta ……................................................................ Dr Auberto Hidalgo Mogollón. Secretario …………............................................................ Dr Eric Mialhe Mantonnier vocal v8i i i CONTENIDO Página RESUMEN X ABSTRACT Xi 1. INTRODUCCIÓN. 12 2. MARCO DE REFERENCIA DEL PROBLEMA. 12 2.1. Antecedentes……………………………………………………………………..12 2.2. Bases teórico-científicas…………………………………………………….......14 2.3. Definición de términos básicos………………………………………………….16 3. MATERIAL Y MÉTODOS. 20 3.1. Localidad y periodo de ejecución……………………………………………….20 3.2. Población, muestreo y muestra…………………………………………………20 3.3. Metodología 21 3.3.1Aislamiento de cepas bacterianas……………..…………………………21 3.3.2 Extracción de ADN genómico de bacterias cultivables………………..21 3.3.3 Caracterización molecular de las cepas cultivables mediante amplificación del gen 16SARNr……………………………….……..21 3.3.4 Caracterización molecular de la microbiota total mediante análisis metagenómico dirigido al gen 16S ARNr…………………..……………………22 9 ix 3.4. Procesamiento y análisis de datos 22 4. RESULTADOS. 24 4.1 Aislamiento e identificación de bacterias……………………………………..24 4.2 Análisis metagenómico dirigido al gen 16S ARNr……………………………27 4.3 Análisis metagenómico en sangre…………………………………………….29 4.4 El análisis metagenómico del tracto digestivo………………………………..30 5. DISCUSIÓN. 32 6. CONCLUSIONES. 45 7. RECOMENDACIONES. 46 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 47 9. ANEXO. 59 10 x RESUMEN La concha negra Anadara tuberculosa, es una especie simbólica del manglar con alto potencial en acuicultura, lo que ha conducido a caracterizar su microbiota en base a tecnologías dependientes e independientes de cultivo in vitro, considerando muestras de sangre (SG) y tracto digestivo (TD) de animales sanos, como una estrategia para el control de agentes patógenos en los cultivos. La microbiota cultivable ha conducido a identificar 5 géneros en SG y 1 solo en TD, siendo el género Vibrio siempre predominante (71% y 100% respectivamente). El análisis metagenómico ha permitido identificar 25 géneros en SG y 239 en TD con una predominancia de Vibrio. En la SG han sido identificados también géneros menores como Lactobacillus, Byssovorax, Pseudomonas, Klebsiella, y Geobacillus. En el TD ha sido evidenciado que los vibrios son los principales residentes (72%) seguidos por Clostridium (11%), Mycoplasma (9%), Ehrlichia (4%) y Psychrilyobacter (3%). Esta caracterización de la microbiota nativa de la concha negra y la disponibilidad de una colección de bacterias cultivables de la SG y del TD van a permitir estudios experimentales para identificar cepas con potencial probiótico extremadamente útiles para el desarrollo de la acuicultura de A. tuberculosa. Palabras clave: bacteria, cultivable, no cultivable, hologenoma, metagenómica, patógeno, probióticos, 16Sr ARN x1i1 ABSTRACT The blood ark "Anadara tuberculosa" is a symbolic specie of mangrove's ecosystem with a high potential in aquaculture, wich conduced to characterize the microbiota by dependent and independent culture methods in vitro considering samples extracted from blood (SG) and digestive tract (TD) of healthy adults as a strategy for pathogen control during culture. The cultivable microbiota led to identificate 5 genus from SG and only 1 from TD, being the genus Vibrio always predominant (71% and 100% respectively). The Metagenomic analyse have allowed to identificate 25 genus from SG and 238 from TD with a predominance of Vibrio. In the SG were also identified other genus with lower prevalence such as Lactobacillus, Byssovorax, Pseudomonas, Klebsiella, and Geobacillus. In the TD it has been evidenced that vibrios are the major resident (72%) followed by Clostridium (11%), Mycoplasma (9%), Ehrlichia (4%) and Psychrilyobacter (3%). This characterization of native microbiota from pustulose arks as well as the availability of a collection of cultivable bacteria from SG and TD will allow experimental studies to identify potential probiotic strains that will be useful for A. tuberculosa's aquaculture development. Key words: bacteria, cultivable, noncultivable, hologenome, metagenomic, pathogen, probiotic, 16S ARNr 12 1. INTRODUCCIÓN. El molusco bivalvo Anadara tuberculosa (Arcidae) o concha negra, es considerado una especie en situación vulnerable debido a la sobre explotación. Se han considerado alternativas de manejo a través de centros de producción de semilla en laboratorio para fines de repoblamiento y sistemas de cultivo acuícolas. Las primeras operaciones de producción de semillas en laboratorio fueron un éxito y representan una esperanza para la sostenibilidad de esta especie a través de la reconversión de los extractores en acuicultores. Sin embargo, algunos de estos primeros cultivos enfrentaron mortalidades masivas asociadas a infecciones bacterianas a nivel de larvas y de reproductores. Las tentativas de esterilización excesiva del agua, así como el uso de antibióticos, resultan costosas y han mostrado ser insuficientes para evitar los episodios de mortalidad. En este contexto, el uso de microorganismos probióticos se presenta como una alternativa factible para la prevención de enfermedades bacterianas en estos cultivos. Estas cepas probióticas compiten con las cepas patógenas mediante la producción de compuestos antimicrobianos y de inhibidores de quórum sensing, pero también por nutrientes y espacio. Los probióticos pueden potenciar la asimilación de alimentos, estimular el desarrollo del aparato digestivo y del sistema inmunitario. Por lo que se plantea la hipótesis de obtener probióticos nativos específicos capaces de colonizar larvas y adultos de A. tuberculosa para lo cual se requiere de conocimientos generales sobre el microbioma asociado a esta especie. Adicionalmente, es conocido que solo una fracción de la microbiota marina total es cultivable mediante los métodos clásicos de microbiología por lo que si se pretende reconstituir una flora microbiana completa de este molusco es necesario un enfoque metagenómico. El objetivo de este estudio fue explorar la composición de la microbiota cultivable y no cultivable asociada a la sangre y al tracto digestivo de individuos sanos de A. tuberculosa, un candidato potencial para la producción acuícola. 13 2. MARCO DE REFERENCIA DEL PROBLEMA. 2.1. Antecedentes A. tuberculosa (Mollusca, Bivalvia), se encuentra distribuida desde el golfo de California en México hasta la región de Tumbes en el Norte de Perú (Baqueiro et al. 1982). Los bancos naturales de esta especie se desarrollan en sedimentos fangosos, en particular alrededor de las raíces de mangle rojo Rhizophora mangle (Camacho 1999). La concha negra, A. tuberculosa, es considerada una especie símbolo del ecosistema manglar del Pacífico y las especies de la familia Arcidae son ampliamente usadas como alimento básico para la preparación de comida tradicional en varios países latinoamericanos tropicales. La extracción de concha negra es una actividad ancestral para las comunidades asociadas al manglar cuya economía se encuentra fuertemente relacionada con el comercio de A. tuberculosa (Lucero, Cantera, y Neira 2011). Sin embargo, la mayoría de los bancos naturales son sobre explotados y algunas poblaciones se encuentran cercanas del colapso en la mayoría de los países (Mora et al. 2011; Lucero, Cantera y Neira 2011). En Perú, las poblaciones de A. tuberculosa de la región de Tumbes se han reducido en un 73,2 % durante el periodo de 1996 a 2007 (Ordinola et al. 2007; Vivar et al. 1996). En este contexto, diferentes proyectos han desarrollado metodologías para una producción de semilla como un paso crucial en la implementación de una estrategia de conservación efectiva para la concha negra, promoviendo alternativas a la extracción a través de la acuicultura social y actividades de repoblamiento (Diringer et al. 2012; Robles et al. 2001; Galdámez 2009). En Ecuador y Perú, las producciones de semilla han tenido éxito, pero varios eventos de mortalidades masivas han sido relacionados a bacteriosis inducidas por especies de Vibrio y Pseudomonas en larvas y reproductores (Diringer et al. 2012). Existe poca información acerca de la microbiota de la concha negra. Pero estudios puntuales realizados han reportado que las concentraciones de Enterobacterias y coliformes en individuos silvestres de A. tuberculosa se 14 encuentran por encima de los niveles recomendados para su consumo (Wong et al. 1997; Fernández et al. 1977). Recientemente, Sánchez et al (2015), evaluaron 8 cepas de bacterias del tracto gastrointestinal de conchas negras adultas como probióticos potenciales para el cultivo del langostino Litopenaeus vannamei, identificando cepas de Bacillus (4), Citrobacter (1), Vibrio (1), Enterococcus (1) y Staphylococcus (1). La alta concentración de materia orgánica y la importante variación de factores abióticos en el lodo del manglar y agua intersticial deben estimular el desarrollo de una fauna particular que habita este ecosistema. Consecuentemente, se podría asumir que la microbiota de A. tuberculosa podría ser específica y favorecería la sobrevivencia en el lodo de manglar. Este concepto conocido como hologenoma considera al hospedero y su microbiota (holobionte) como una única unidad de selección donde la plasticidad genética del huésped se ve reforzada a través de la capacidad de adaptación de su composición microbiana frente a un cambio ambiental (Zilber Rosenberg et al. 2008). 2.2. Bases teórico-científicas. De forma general las mortalidades en la acuicultura de moluscos están causadas por patologías bacterianas, siendo los principales agentes etiológicos miembros del género Vibrio (Beaz et al. 2010; Paillard et al. 2004; Romalde et al. 2010, 2014, 2015; Travers et al. 2015). Además, las condiciones óptimas para el cultivo de moluscos también favorecen el crecimiento de bacterias y la acumulación de sus metabolitos (Murchelano et al. 1975; Prieur et al. 1979). Guillard (1959) documentó los primeros reportes que revelan la participación de una especie de Vibrio en la destrucción del velo y los tejidos internos de larvas de la almeja Mercenaria mercenaria, causando una mortalidad del 70% de la población. Posteriormente, se propuso el término "necrosis bacilar" (Tubiash et al., 1965) para describir esta enfermedad. En particular Vibrio alginolyticus, Vibrio tubiashii y Vibrio anguillarum han sido relacionadas a muertes masivas de larvas por síndrome de necrosis bacillar (Romalde et al. 2015; Elston 1980; Riquelme et 15 al. 1995, 1996, 2001, 2015), afectando a numerosos bivalvos como Crassostrea virginica, Ostrea edulis, M. mercenaria, Argopecten irradians y Teredo navalis. Así también una de las epidemias más importantes es el síndrome de la mortalidad de verano que ha sido reportada para Ostras. Esta puede ser atribuida no solo a patógenos bacterianos o al Herpesvirus OsHV1 de la ostra, sino a un complejo de interacciones entre el estado fisiológico y genético del hospedero, factores ambientales y la presencia de varias especies de vibrios oportunistas infecciosos (Romalde 2015). Por otro, lado durante las dos últimas décadas, se ha hecho evidente que la microbiota proporciona a sus huéspedes una gama de beneficios, incluyendo la defensa frente a patógenos externos. Otros estudios han sugerido que una pequeña proporción de bacterias cultivables que residen en la hemolinfa de C. gigas pueden prevenir el establecimiento de patógenos y podrían jugar un rol importante en la defensa de los bivalvos (Defer et al. 2013; Desriac et al. 2013). Estudios sobre el efecto de antibióticos producidos por bacterias marinas han sido reportados en la supervivencia de las larvas de la viera Pecten ziczac (Lodeiros et al. 1989). También se han desarrollado estudios sobre la aplicación de una bacteria probiótica, Pseudoalteromonas haloplanktis, en larvas de A. purpuratus (Riquelme et al. 1996), así como sobre la determinación de su espectro de actividad contra diferentes especies bacterianas, incluyendo miembros del género Vibrio. El potencial probiótico de algunas bacterias se basa en la producción de metabolitos secundarios secretados durante la fase estacionaria de crecimiento. A pesar de la abundancia y diversidad de los microorganismos en los ambientes acuícolas, hasta el 99% de las especies bacterianas no son cultivables y, por lo tanto, la diversidad microbiana es generalmente subestimada (Streit, 2004). En acuicultura, la abundancia de materia orgánica en el medio de cultivo lo hace un ambiente propicio para la proliferación de microorganismos (Martínez et al. 2009). La evaluación de la diversidad y los roles hipotéticos de estos microorganismos especialmente los no cultivables es posible a través de técnicas de genómica funcional y metagenómica (Riesenfeld et al. 2004). 16 La metagenómica ha surgido como una herramienta científica prometedora para el análisis de especies microbianas cultivables, difícilmente cultivables y no cultivables contenidas dentro de un ecosistema específico. A pesar de la importancia económica de los bivalvos en acuicultura y de su probable riqueza microbiana, pocos estudios han descrito la microbiota asociada a bivalvos usando esta poderosa técnica. La composición microbiana del tracto digestivo de ostras ha sido analizada en los últimos años (Kings et al. 2012; Trabal et al. 2012 y Chauhan et al. 2014), mientras que otros grupos científicos se dirigieron a la investigación de los cambios de la microbiota de la hemolinfa en la ostra del Pacífico bajo condiciones de estrés de temperatura e infección con vibrios (Lockmer et al., 2014). En conjunto, los resultados de metagenómica han demostrado que la ostra alberga un microbioma más diverso que aquel generalmente caracterizado por microbiología clásica (Garnier et al. 2007; Najiah et al. 2008). 2.3. Definición de términos básicos. ADN: El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN, es un ácido nucleico que contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos así como de la mayoría de virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. Tiene una estructura doble cadena complementaria y antiparalela. La unidad formadora del ADN es el nucleótido y cada nucleótido, a su vez, está conformado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser Adenina→A, Timina→T, Citosina→C o Guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche con el siguiente nucleótido (Helmut 2015). Datos crudos (raw data): También conocido como datos primarios, es un término para datos que no han sido sometido a procesamiento o cualquier otra manipulación (Pollock 2007). Gnotobiología: Del griego “Gnosis” que significa “conocimiento” y “bios” por “vida”, corresponde al estudio de organismos exentos de microorganismos o asociados con microorganismos conocidos o específicos. Esta ciencia tiene como tópico revelar las interacciones colaborativas entre el epitelio digestivo, el sistema 17 inmune de la mucosa del intestino de un huésped y su microbiota. Su estudio permitirá de controlar el establecimiento de una flora microbiana normal y protectora como elemento primordial para el desarrollo y la maduración del sistema digestivo e inmunitario, y posteriormente para la resistencia a las enfermedades infecciosas (Falk 1998). Hologenoma: El concepto de hologenoma fue introducido por Zilber- Rosenberg y Rosenberg (2008). Se considera al huésped y a sus microorganismos asociados (microbiota) como un supra organismo (holobionte). Este concepto se basa en: (1) relaciones simbióticas entre el huésped y sus microorganismos; (2) la transmisión inter individuos de los simbiontes; (3) la existencia de beneficios mutuales en la asociación entre el huésped y sus microorganismos; y (4) la mejora de la capacidad de adaptación del holobionte frente a un estrés abiótico (Zilber et al. 2008). PCR: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, para obtener billones de billones de copias (Mullis 1998). Metagenómica microbiana: Es una técnica de análisis genómico de las comunidades microbianas que no requiere cultivo. Es el estudio de los genomas colectivos de los miembros de una comunidad microbiana que reside en un ecosistema particular. El término se deriva del concepto estadístico de meta- análisis (el proceso de combinar estadísticamente análisis por separado) y la genómica (el análisis exhaustivo del material genético de un organismo) (Martínez. 2015). Microbioma: Este término refiere al hábitat entero, incluyendo los microorganismos, sus genomas (genes) y el medio ambiente alrededor. Esta definición es basada sobre la de “bioma”, que corresponde a la suma de factores bióticos y abióticos de un ecosistema (Abraham 2005). 18 Microbiota: El consorcio de microorganismos presentes en un ecosistema determinado (Quigley 2010). Microbiota cultivable: Es aquella que tiene la capacidad de crecer en condiciones artificiales proporcionada por un medio de cultivo que puede ser general o especifico, mediante la asimilación de los nutrientes que proporciona el medio de cultivo (Corral 2000). OTUs: Unidad Taxonómica Operacional, correspondiente a una “unidad de análisis filogenético” seleccionada por el usuario para ser utilizado en un estudio, y que puede corresponder a individuos, poblaciones, especies, géneros o cepas bacterianas (Blaxter 2005). Patógeno: Un patógeno es generalmente definido como un microorganismo capaz de causar una enfermedad. Algunos autores han propuesto definiciones que abarcan los patógenos clásicos y patógenos oportunistas, definiendo a un patógeno como un microorganismo capaz de causar daños al hospedador. El daño puede resultar directamente de la acción microbiana o indirectamente a través de daños generados por la respuesta inmune del huésped (Casadevall, y Pirofski 2002). Probiótico: Es un aditivo microbiano vivo que ejerce un efecto beneficioso para el huésped mediante: 1) la modificación de la microbiota asociada al hospedador o al medio ambiente; 2) el mejoramiento de la utilización del alimento o de su valor nutricional; 3) el incremento de la respuesta inmune del huésped frente a un patógeno; 4) la mejora de la calidad de su medio ambiente (Verschuere, y Rombaut 2000). Las características deseables de una bacteria probiótica para su uso en acuicultura de bivalvos incluyen:1) ser aislada del ambiente en el que se empleará, lo que evita los riesgos de introducción de microorganismos exóticos en el sistema y asegure que esté adaptada a las condiciones de cultivo; 2) tener efectos beneficiosos para el animal cultivado, y 3) no ser patógena o tóxica para el molusco en cultivo, sino también el fitoplancton u otros alimentos vivos (Prado, y Romalde 2010). Quorum Sensing: Es un sistema de intercambios de estímulos y respuestas microbianas correlacionadas con una densidad de población. Muchas especies de 19 bacterias utilizan el quórum sensing para coordinar la expresión de genes o de ciertos comportamientos tales como la formación de bio películas, la virulencia y resistencia a los antibióticos, basándose en la densidad local de la población bacteriana. Este sistema de “comunicación” molecular involucra una gran variedad de moléculas señales que pueden ser detectadas de forma intra o inter específicas (Chun 2012). Secuenciación de ADN: Es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable que forma la base de los programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en el núcleo celular y en los plásmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas) (Sanger 1975; Church 2006; Ronagh 1996; Laurent 1998). 20 MATERIAL Y MÉTODOS. 3.1. Localidad y periodo de ejecución. El estudio se realizó en los laboratorios de la empresa Inca Biotec S.A.C y la Facultad de ingieneria pesquera y ciencias del mar de la Universidad Nacional de Tumbes. La recolección del material biológico fue llevada a cabo en la zona de maglares de Puerto Pizarro, en la región de Tumbes, provincia de Tumbes. 3.2. Población, muestreo y muestra. Las muestras fueron recolectadas a partir de las poblaciones de bancos naturales ubicados en el manglar de Tumbes, en las coordenadas de 3°30’12.96”S - 80°23´55.87”O, durante el verano 2014-2015 e ingresadas al laboratorio de experimentación y producción del CEBAP (Centro Colectivo Educativo Experimental de Biología y Biotecnología Acuática y Acuícola de Puerto Pizarro). Las muestras fueron extraídas manualmente con la ayuda de un extractor “conchero”, cepilladas y lavadas con agua de mar con la finalidad de remover detritus y posibles epibiontes. Los individuos fueron seleccionados por tallas superiores o iguales a la talla mínima legal de extracción (≥4.5 cm) y fueron ingresados a un sistema de depuración previa por un período de 48 horas a 28°C y 35 ppt con aireación constante en tanques de 700 L llenados con agua filtrada (1 µm), tratada con 10 ppt de hipoclorito de calcio y neutralizada con thiosulfato de sodio. Se extrajo la SG asépticamente y de manera individual mediante la inserción de una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 1 ml directamente en el músculo aductor posterior, succionando un máximo de 0.5 ml mezclado v/v con citrato de sodio al 10%. Las muestras fueron individualmente observadas al microscopio, para verificar el buen estado de los hemocitos. Para el caso del contenido del TD, se extrajo mediante un corte longitudinal ayudado con hojas de bisturí estéril y depositado en tubos de micro centrifugación de 1.5 ml y fueron directamente procesados. 21 3.3. Metodología 3.3.1. Aislamiento de cepas bacterianas Se inoculó 20 µl de sangre extraida de A. tuberculosa en placas que contenian 15 ml de dos tipos de medio: el medio sólido no selectivo Tripticasa Soya Agar (TSA, Sigma) y el medio selectivo M.R.S (Man, Rogosa y Sharpe, Sigma) ambos suplementados con NaCl al 2%. Las placas fueron incubadas por periodos de 18 a 24 horas a 37°C. Se escogió preferencialmente las colonias que presentaban morfologías diferentes y algunas colonias fueron recuperadas aleatoriamente. La purificación se realizó mediante la técnica de estriado en placa, la pureza de cada cepa se evaluó mediante tinción de Gram y el proceso de purificación fue repetido hasta obtener cepas puras. Las bacterias puras se sembraron en medio líquido LB (Luria Bertani, Sigma) suplementadas con 2% de Nacl. Para la conservación prolongada de las cepas, se adicionó 25% de glicerol estéril (v/v) en 1 ml de cultivo en fase estacionaria y se almacenó a -20°C. 3.3.2. Extracción de ADN genómico de bacterias cultivables Se extrajo 1 ml de cultivo de cada cepa pura que fue centrifugado a 13000 rpm, el sobrenadante fue descartado. El ADN fue obtenido siguiendo el método de extracción descrito por el fabricante (Kit Concepto azul). La concentración fue determinada por lectura de absorbancia a 260 nm y la pureza evaluada utilizando los ratios A260/280 y A260/230 por espectrofotometría (Eppendorf biophotometer model AG). 3.3.3. Caracterización molecular de las cepas cultivables mediante amplificación del gen 16S ARNr La región ARNr 16S fue amplificada mediante PCR utilizando los iniciadores universales 27F (AGAGTTTAGTCMTGGCTCAG) - 1492R (GGYTACCTTGTTACGACTT) (Weisburg., 1991), que generan un producto de alrededor de 1500 pb. El mix de PCR de un volumen final de 25 μl, consistió de 2.5 μl buffer 10 X, 2.5 μl MgCl2 25 mM, 0.6 μl dNTPs a 10 mM y 2 U de Taq DNA polymerase (Thermo scientific). Las condiciones usadas para la PCR fueron: 22 desnaturalización inicial de 95°C por 5 minutos, seguidos por 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 segundos, hibridación a 55°C por 45 segundos, elongación a 72°C por 1 minuto y una elongación final a 72°C por 10 minutos. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de electroforesis a una concentración de 1.5% de agarosa, los amplicones de tamaño esperado fueron enviados a secuenciar a Macrogen USA, utilizando los iniciadores internos 518F (CCAGCAGCCGCGGTAATACG) - 800R (TACCAGGGTATCTAATCC) (Lane 1991). 3.3.4. Caracterización molecular de la microbiota total mediante análisis metagenómico dirigido al gen ARNr 16S. Las muestras de sangre y de tracto digestivo de 3 adultos sanos de A. tuberculosa extraídas asépticamente fueron colocadas individualmente en microtubos y el ADN total fue extraído con un kit (PowerSoil®, Mo Bio) según las indicaciones del fabricante. La calidad y cantidad del ADN de las 6 muestras fueron evaluadas por espectrofotometría (Eppendorf biophotometer model AG) como se describió anteriormente. Todas las muestras presentaron un ADN puro y fueron enviadas a Mr DNA (Shallowater, TX, USA) para ser secuenciadas en la plataforma PGM™ (Ion Personal Genome Machine System - Thermo Fisher Scientific). 3.4. Procesamiento y análisis de datos El análisis filogenético de las cepas cultivables aisladas se realizó únicamente a partir de las secuencias que presentaban pictogramas legibles. Las secuencias fueron reconstituidas utilizando el programa MEGA 6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0), luego se comparó las secuencias completas con la base de datos del NCBI de GenBank. Se atribuyó una clasificación hasta el nivel de especie únicamente para las secuencias con valores de 99 a 100% de similitud. Los valores de similitud para próximos filogenéticos fueron determinados usando el programa FASTA. Los árboles filogenéticos fueron construidos por el método de neighbour-joining, usando un bootstrap de 1000 repeticiones con el programa de alineamiento MEGA 6. 23 El análisis de metagenómica dirigida fue realizado a partir de productos de amplificación por PCR de la región variable V4 del gen ARNr 16S utilizando los iniciadores universales 515F y 806R (Caporaso 2012). El protocolo detallado utilizado por el proveedor está disponible en www.mrdnalab.com. Los datos de las secuencias fueron procesados mediante la plataforma de “análisis pipeline” del proveedor. Las secuencias menores a 150pb fueron removidas. Las unidades taxonómicas operacionales (OTUs) fueron definidas por similitud de secuencias al 97%. Las OTUS obtenidas fueron clasificadas taxonómicamente usando BLASTn, y comparadas con una base de datos curada derivada de greengenes, RPDII y NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, (DeSantis et al. 2006), http://rdp.cme.msu.edu) (Caporaso 2011). La totalidad de las secuencias crudas (raw), fueron procesadas a partir de un formato fasta qual pipeline utilizando el programa binning (MR DNA) y depositadas en el servidor público MG-RAST (versión 3.2 Argone National Laboratory http://metagenomics.anl.gov/metagenomics.cgi?page=Analysis). Las secuencias de cada muestra fueron cargadas usando IDs: CNE1 4635920, CNE2 4635919, CNE3 4635918 para muestras del TD y CNH1 4635922, CNH2 4635921 para las de SG, respectivamente. La asignación de los valores máximos fue un e- value -30. Para la designación filogenética a nivel de género se utilizó un 95% de similitud en la base de datos de RDPII. Adicionalmente, se utilizó el programa de comando lineal Mothur 10.0. Las secuencias legibles de OTUs fueron usadas para generar índices de diversidad, como el índice de diversidad alfa, índice de equidad Shannon-Weaver (Shannon y Weaver. 1949), el índice de dominancia de Simpson y las curvas de rarefacción. 24 4. RESULTADOS 4.1 Aislamiento e identificación de microorganismos. Un total de 15 reproductores de A. tuberculosa fueron muestreados entre los meses de verano desde diciembre 2014 hasta febrero 2015, obteniendo 76 cepas de bacterias aisladas. La caracterización molecular mediante secuenciación y análisis del gen ARNr 16S, permitió identificar 51 cepas aisladas de muestras de SG y 25 provenientes de muestras de TD de A. tuberculosa. De estas, 19 cepas provenientes de la SG y 13 provenientes del TD presentaban diferencias de secuencias significativas y fueron seleccionadas para el análisis filogenético (Figura 1). Se encontró que la mayor parte de las bacterias aisladas (74.5%) para SG y (100%) para TD fueron asignadas dentro del filo Proteobacteria, y de manera específica a la clase Gammaproteobacteria en el caso de las muestras de TD, mientras que este filo fue seguido por Firmicutes (25.5%) en las muestras de SG. En particular se aprecia la alta prevalencia de bacterias Gram-negativas relacionadas al género Vibrio con 70.6% y 100 % en SG y TD, respectivamente (Tabla 1). Los análisis filogenéticos de la microbiota cultivable de A. tuberculosa permitieron identificar 2 filos (Proteobacteria y Firmicutes), correspondientes a 2 clases (Gammaproteobacteria y Bacilli), repartidas en 5 géneros (Acinetobacter, Vibrio, Enterobacter, Staphylococcus, Macrococcus, Bacillus) en la SG, mientras que se identificó solamente 1 género (Vibrio) en el TD (Fig. 1). 25 26 Figura 1: Relación filogenética de bacterias aisladas de la sangre y del tracto digestivo de A. tuberculosa en base a las secuencias del gen ARNr 16S. El patrón de ramificación fue generado por el método de neighbor-joining. El número de bootstrap indica valores mayores de 700Bar, a una escala de 0.5. ( ) Bacterias presentes en sangre, (+) bacterias presentes en el tracto digestivo. 27 4.2 Análisis metagenómico dirigido al gen ARNr 16S En este estudio, la microbiota residente en la sangre (SG) y el tracto digestivo (TD) de la concha negra A. tuberculosa fue caracterizada usando la plataforma de secuenciación de alta eficiencia PGM™, y estuvo basado en la secuenciación parcial del gen ARNr 16S (región variable V4) para la identificación de la microbiota total. La sangre (SG) y parte del tracto digestivo (TG) de 3 animales adultos y sanos, o sea 6 muestras fueron extraídas y enviadas a secuenciar individualmente. De estas 6 muestras, 1 de SG (SG 3) no obtuvo amplificación a pesar de haber sido enviada con ADN de similar cualidad. En cuanto a las 5 muestras restantes, el análisis de secuencias produjo en total 133,298 lecturas crudas (raw) con un estimado de tamaño de cobertura promedio de 257 pb para todos los tejidos de A. tuberculosa. Después de la eliminación de 3.7% de secuencias ilegibles, un total de 126,550 lecturas válidas con una longitud ≥ 150 pb fueron usadas para los análisis posteriores. El conjunto de OTUs fue identificado usando la plataforma de MG RAST y la base de datos RDPII (Cole et al. 2009), con una tasa de confiabilidad umbral de identidad de secuencias ≥ 80% y ≥ 97% a nivel de filo y género, respectivamente (Tabla 2) Tabla 2: Número de OTUs observados por muestra, basados en la clasificación de secuencias por MG RAST y evaluación de los índices de diversidad específica. N° de Diversidad índice N° # Lecturas N° Diversidad Especie Accession Tejido Shannon- Simpson Lecturas utilizadas OTUs α MG-RAST Weaver (H´) (1-´λ) A. tuberculosa 4636008.3 TD 1 41,008 37,919(92.5%) 89 3.57 0.7954 6.24 A. tuberculosa 4636006.3 TD 2 21,751 20,582 (94.6%) 117 3.759 0.8236 4.41 A. tuberculosa 4636007.3 TD 3 58,923 56,430 (95.8%) 85 3.424 0.793 6.57 A. tuberculosa 4636010.3 SG 1 7,735 7,847 (101.4%) 11 3.172 0.8435 1.42 A. tuberculosa 4636009.3 SG 2 3,881 3,772 (97.2%) 31 2.612 0.8116 1.63 *Número (porcentaje en paréntesis) de secuencias asignadas a un filo dado usando RDPII (Cole et al., 2009) El análisis filogenético de las secuencias por MG RAST utilizando la base de RDP permitió identificar 6 filos disgregados en 7 clases y 25 géneros en la SG y 23 filos correspondientes a 34 clases y 239 géneros en el TD (Figura 3). 28 Los OTUs fueron definidos usando una secuencia del gen ARNr 16S con similitud de corte de 97% con el RDP (Cole et al., 2009). Las curvas de rarefacción permitieron el análisis del número de especies entre las muestras aun cuando los tamaños de las mismas fueron desiguales, calculando el número esperado de especies relativo de cada muestra transformándolas a un tamaño estándar. La muestra TD 3 presentó un mayor número de lecturas; 56,430 con cerca de 62 especies reportadas, mientras que TD 2 presentó un menor número de lecturas (20,582) pero reportó el mayor número de especies (89) en relación a las otras muestras. La curva con menor número de lecturas (3,772) y especies reportadas correspondió a la muestra SG1 (Figura 2). Muestras de tejidos de A. tuberculosa Tracto digestivo (TD) 1 Sangre (SG) 1 Tracto digestivo (TD) 2 Sangre (SG) 2 Tracto digestivo (TD) 3 Figura 2: Muestra la diversidad de OTUs al 95% de la microbiota asociado tanto a la sangre como al tracto digestivo de Anadara tuberculosa mediante las curvas de rarefacción designadas a cada muestra. 29 4.3 Análisis metagenómico en sangre (SG). De las 3 muestras de sangre (SG) de A. tuberculosa enviadas a secuenciar, solamente 2 de las muestras (SG1 y SG2), fueron exitosamente secuenciadas y su composición será descripta a continuación. Los análisis de secuencias utilizando RDP permitieron observar que las Proteobacterias dominan masivamente la microbiota (99.41% y 96.75%) seguidas por las Firmicutes (0.59% y 1.61%) en las muestras de SG1 y SG2. Algunos filos de importancia menor (abundancia relativa inferior a 1%) están presentes en la segunda muestra: Actinobacteria, Deinococcus, Thermus, Ascomycota y Chloroflexi. Dentro de los 2 filos dominantes, las clases más abundantes son las Gammaproteobacteria (98.77% y 96.36%) y los Bacilli (0.59% y 1.61%). Bacterias de las clases de Actinobacteria, Delta y Betaproteobacteria, Deinococci, Eurotiomycetes y Alfaproteobacteria también están presentes, pero con una participación muy reducida en la microbiota (Fig 3). En el análisis de secuencias de SG se obtuvieron 8 y 21 géneros de bacterias (> 97% de similitud con referencia a RPD), en las muestras de SG 1 y SG 2, respectivamente, sin embargo, solo 1 género de la muestra SG1 y 4 géneros de SG2 poseen abundancia relativa ≥ 1%, indicando una diversidad de géneros relativamente limitada. El análisis metagenómico indicó que el género Vibrio presenta una fuerte predominancia en relación a los otros géneros, con una prevalencia relativa de 98.29%, seguido por Lactobacillus 0.59%, Byssovorax 0.52% y Pseudomonas 0.25% en la muestra SG 1 mientras que en la muestra SG 2 el género Vibrio representó el 92.02% seguidos por Pseudomonas (2.12%), Klebsiella (1.31%) y Geobacillus (1.03%). 30 4.4 El análisis metagenómico del tracto digestivo (TD). El proceso de secuenciación con la plataforma PGM™ logró obtener secuencias de las 03 muestras de tracto digestivos (TD) extraídas de los 3 individuos sanos de A. tuberculosa. El análisis filogenético por MG RAST utilizando la base de RDP permitió identificar un total de 23 filos, repartidos entre las muestras TD1, TD2 y TD3 (21, 16 y 18 filos respectivamente). A pesar de la aparente riqueza filogenética de las muestras de TD, muy pocos filos presentaron abundancias relativas superiores al 1%. La muestra TD1 apareció como la más diversa con 7 filos (Firmicutes (35.01%), Tenericutes (29.79%), Proteobacterias (22,37%), Fusobacteria (6.87%), Spirochaetes (3.09%), Actinobacteria, (1,06%), y Bacteroidetes (1.06%)) mientras las muestras TD2 y TD3 contaban únicamente con 3 filos predominantes cada una. Ambas muestras TD2 y TD3 eran fuertemente dominadas por Proteobacteria (94.41% y 85.98%), seguidos por Tenericutes 3.77% y Fusobacteria 1.15% para el TD2 y con Firmicutes 9.49% y Cyanobacteria 1.39% para el TD3. 31 Figura 3: Composición filogenética (Filo, Clase, género) de todos los OTUs encontrados en SG y TD de A. tubeculosa, la denominación All (todos los OTUs encontrados en las muestras de SG y TD) Share (OTUs compartidos de las 2 muestras de Sg y 3 muestras de TD), Uniq ( OTUs únicamente presentes en una muestra de SG y TD). 32 5. DISCUSIÓN Los resultados del estudio de la microbiota cultivable de 15 individuos sanos de A. tuberculosa indicaron que la clase Gammaproteobacteria fue dominante en la sangre (SG), seguida por Bacilli. Los aislados más frecuentes fueron V. sp. cepa 41 (11.8%), Staphylococcus aureus subsp. aureus (7.8%), V. neocaledonicus cepa MS1 (7.8%), V. alginolyticus cepa NBRC 15630 (5.9 %), y V. sp. Y1-10 (5.9%) y fueron encontradas en varios individuos. Estos datos de la microbiota cultivable difieren en diversidad con los reportes para A. broughtoni, donde si bien Gammaproteobacteria fue el grupo dominante, no se encontraron especies del género Vibrio en la SG (Romanenko et al. 2008). Adicionalmente un 17% de todos los aislados fueron bacterias Gram positivas en comparación al 25.5% de los reportados para este estudio. Los aislados obtenidos a partir de la microbiota cultivable en el tracto digestivo (TD) pertenecieron a la clase Gammaproteobacteria en su totalidad, siendo los aislados más frecuente V. harveyi cepa EHP13 (16%), seguido por V. neocaledonicus cepa MS1 (12%) y V. alginolyticus cepa NBRC 15630 (8%). Esto podría deberse a la amplia distribución del género Vibrio (más de 100 especies) en los ambientes acuáticos estuarinos (Romalde 2014), por lo que podrían ingresar al TD de este bivalvo mediante la filtración y alimentación. En A. tuberculosa las cepas de vibrios reportadas tanto en SG como en TD son V. neocaledonicus cepa MS1, V. sp. Y1-10, V. alginolyticus cepa NBRC 15630, V. parahaemolyticus UCM-V493, V. parahaemolyticus BB22OP, por lo que podría considerarse una microbiota núcleo para esta especie. Por otro lado, muchas especies de vibrios han sido asociadas a episodios de mortalidades en moluscos afectando seriamente los cultivos y causando cuantiosas pérdidas en centro de producción de semillas, así como en bancos naturales. En particular V. alginolyticus, V. tubiashii y V. anguillarum han sido relacionadas a muertes masivas de larvas por síndrome de necrosis bacillar (Romalde. 2015; Elston et al. 1980; Riquelme et al. 1995, 1996, 2015). Así también una de las epidemias más importantes es el síndrome de la mortalidad de 33 verano, que ha sido reportada para ostras, y que parecería estar principalmente relacionados a vibrios patógenos en lugar de la presencia del Herpesvirus OsHV1 como se consideraba anteriormente (Petton et al. 2015). Otras especies son consideradas de riesgo para la salud humana tal es el caso de V. parahaemolyticus, que ha sido registrado en tejidos de la especie Anadara granosa (Bilung 2005). En la misma especie se han registrado 19 cepas bacterianas indicadoras de polución como: Staphylococcus capitis, S. lentus, S. epidermidis, S. xylosus (Jalal et al. 2009), mientras que para A. tuberculosa en este estudio se reportó la especie Gram positiva Staphylococcus aureus, así como también la cepa Gram negativa Acinetobacter sp, (McDonald 1999) por lo que su monitoreo es un eje a tomar en cuenta para estudios de seguridad alimentaria. En este estudio, ninguna especie del género Pseudomonas ha podido ser aislada a pesar de que este grupo junto con las especies de Vibrio predominan en las bacterias cultivables en bivalvos (Romalde et al. 2015, 2010; Garnier et al., 2007) y en arcas (Kueh 1985; Bilung et al. 2005).Por otro lado en A. tuberculosa, la presencia de Pseudomonas sp ha sido relacionada a eventos de mortalidades en semillas y adultos (Diringer et al. 2012). Finalmente es sorprendente la menor diversidad de bacterias en TD con respecto a la SG. Una explicación posible podría orientarse a que los animales analizados fueron depurados, lo que limita el aislamiento de la flora no adherida. Además las cepas aisladas de TD presentaban generalmente un esparcimiento en placas muy rápido, que explicaría su capacidad para colonizar el TD. Sin embargo es importante de tener en cuenta que los microorganismos marinos capaces de crecer sobre los medios actuales (microorganismos cultivables) no representan más del 1% del total de la población presentes en el agua (Allan et al. 1995). El análisis metagenómico se condujo sobre 3 muestras de tracto digestivo (TD1, TD2 y TD3) y 2 de sangre (SG1 y SG2) extraídos de 3 individuos sanos de A. tuberculosa. No se explica precisamente porque una muestra de sangre (SG3) no pudo ser secuenciada a pesar de presentar una calidad y concentración de ADN correcta y de haber sido amplificada por el gen 16S ARNr exitosamente por 34 PCR previamente a su envió. Se supone una degradación durante el transporte, o una mala manipulación durante su tratamiento. El análisis de las 5 muestras restantes se realizó mediante PGM™ Ion torrent y produjo 133,298 lecturas crudas (raw), después de la eliminación de 3.7% de secuencias consideradas artefactos o ruido de fondo, un total de 126,550 lecturas válidas fueron usadas con una longitud ≥ 150 pb. El limitado tamaño de los amplicones generados por PGM™ y por las técnicas actuales de NGS en general limita el uso de los amplicones del gen 16S ARNr para discriminar más allá del nivel de género (Liu et al., 2000). En conjunto, un gran número de secuencias de alta calidad, con tamaños promedios parecidos fueron obtenidos y pudimos comparar los diferentes tipos de muestras entre los individuos. Es importante resaltar que en metagenómica es el número de OTUs y no necesariamente el número de especies que refleja la diversidad microbiana. Los resultados del análisis para la evaluación de la diversidad ecológica utilizados fueron: Diversidad α, Diversidad Shannon Weather (H´) y el índice Simpson (1-´λ), los resultados pueden ser correlacionados con las curvas de rarefacción (Fig.2). Primero, se observa claramente que la diversidad α que consiste en la evaluación de la diversidad total y local de una comunidad es más elevada en muestras de tractos digestivos que en muestras de SG, indicando a priori un mayor número de especies. Sin embargo, la diversidad α es dependiente de la profundidad de la lectura (número de secuencias obtenidas) (Hill 1973) y debe ser relacionada con los índices de diversidad Shannon y Simpson que no son tan sensibles a la profundidad de lectura (Haegeman et al. 2013). El índice de Simpson a su vez es más influenciado por las especies dominantes que la diversidad Shannon que es sensible a los OTUs pocos comunes. Los índices de diversidad de Shannon– Weaver (H′) y Simpson confirman que la microbiota es más diversa en los tractos digestivos (TD) que en la SG. Los resultados inferiores del índice Simpson en las muestras del TD1 y TD3 indican que estas muestras presentan más diversidad que el TD2 a pesar de tener menores números de lecturas. Finalmente el TD2 muestra el mayor índice de Shannon–Weaver (H′) indicando que presenta la mayor cantidad de OTUs. En cuanto al análisis de rarefacción, este fue realizado para estimar si la totalidad de los OTUs presentes en las muestras han sido recuperados considerando un nivel de identidad de secuencia de 97%. Se puede 35 apreciar que ninguna de las curvas alcanzó una saturación o fase meseta sugiriendo que algunos OTUs quedaron inadvertidos. Sin embargo, los OTUs menos importantes encontrados en las muestras representan importancias relativas muy inferiores al 0.1% sugiriendo que los OTUs inadvertidos no son realmente relevantes en la ecofisiología del animal. La predominancia del filo Proteobacteria en las muestras analizadas por metagenómica en SG no es sorprendente cuando se considera que Proteobacteria es el filo más grande y fenotípicamente más abundante; y que las clases como Gamma y Alfaproteobacteria son particularmente abundantes en los ecosistemas marinos. Estos resultados difieren parcialmente de los obtenidos en la metagenómica de la microbiota circulante por Lockmer et al. (2014) en ostras sanas C. gigas. En su estudio, el filo Proteobacteria (> 60%) y Bacteroidetes (>30%) abarcan la mayor parte de diversidad de OTUs y abundancia. Particularmente estos autores encontraron que las Gammaproteobacteria representaban menos del 6% de todas las clases evidenciando importantes diferencias entre este modelo y A. tuberculosa. Los tejidos de los moluscos bivalvos sanos son conocidos por albergar naturalmente una importante comunidad microbiana, ya sea a nivel gastrointestinal (Gómez et al. 2010; King et al. 2012; Trabal et al. 2012), de branquias (Wegner et al. 2013) o de la hemolinfa (Olafsen et al. 1993; Garnier et al. 2007; Wendling et al. 2014; Lockmer et al. 2014) resultando en una estimación más alta y cambiando el enfoque antiguo que la microbiota de la ostra estaba dominada generalmente por Vibrio y Pseudomonas (Prieur et al. 1990; Olafsen et al. 1993; Garnier et al. 2007). El único estudio de metagenómica obtenido a partir de muestras de hemolinfa de ostras sanas confirmó esta teoría al presentar una gran microbiota dominada por 11 géneros de mayor importancia. En particular, los OTUs asignados a género Vibrio fueron comunes (presentes en 98.85% de las muestras, pero no muy abundantes (5,1%, abundancia) (Lockhmer et al. 2014). Mientras que para A. tuberculosa la microbiota a nivel de SG se encuentra porcentualmente dominada por el género Vibrio en las dos muestras analizadas con un 98.29% y 92.02% respectivamente. 36 El análisis de composición de la microbiota circulante promedio, compartida y única (Figura 3) permite analizar las diferencias y similitudes entre las muestras. La preponderancia del género Vibrio en ambas muestras se refleja en los análisis de composición promedio y compartida. Pseudomonas es el único género que tiene una presencia compartida significativa aunque es muy baja (1.1%). En cuanto a la microbiota única, el gráfico permite de cuantificar proporcionalmente entre todos los OTUs de géneros bacterianos únicos a los que se encuentran en un solo individuo. Los principales OTUs únicos en la SG pertenecen a las Klebsiella, 22.5%, Geobacillus (17.8%), Lactobacillus (11.5%), Corynebacterium (9.3%) Enterobacter (8.6%), y Knoellia (6.3%). Sin embargo, la baja prevalencia en la SG de estos géneros (inferiores a 1%), y la falta de representatividad (solo 2 muestras analizadas) impiden interpretar correctamente estos datos. En el caso de la microbiota total circulante de la SG de A. tuberculosa, se presenta muy similar a la microbiota cultivable aislada en este estudio con una dominancia neta del género Vibrio y la presencia esporádica de bacterias de tipo Bacilli. La presencia de bacterias viables en la SG de los animales sanos puede influir en el resultado de las infecciones de patógenos, ya sea mediante la estimulación de la inmunidad o por exclusión competitiva (Schmitt et al., 2012); Recientemente el aislamiento de compuestos antimicrobianos de origen bacteriano provenientes de la hemolinfa de ostra ha proporcionado el soporte para la última hipótesis (Defer et al. 2013). Las bacterias aisladas capaces de producir estos componentes antimicrobianos fueron del grupo de Gammaproteobacteria y pertenecían a los géneros Pseudoalteromonas y Vibrio. Este concepto de bacterias “inmunitarias” es interesante, aunque éstas representan menos del 2% de las cepas evaluadas. Además, muchas especies de Vibrio son consideradas importantes patógenos en acuicultura y han sido asociadas a dramáticas perdidas en cultivos larvarios como en bancos naturales y acuícolas (Romalde et al. 2010; Romalde et al. 2014; Travers et al. 2015). Del mismo modo, la presencia compartida de miembros del género Pseudomonas (2.12% y 0.25%) y su rol en la microbiota debería ser investigado ya que ha sido anteriormente descrito como un patógeno para larvas de bivalvos en particular en A. tuberculosa (Diringer et al. 2012). 37 Aunque el mismo taxón bacteriano puede albergar especies o cepas dentro de la misma que pueden ser virulentas como no virulentas, la correlación entre las especies de vibrios cultivables aislados en este estudio y que incluye cepas que son patógenas a vertebrados e invertebrados marinos o terrestres y la masiva predominancia de estos vibrios dentro del sistema circulatorio de la concha negra es llamativo y plantea varias preguntas; 1) Estos vibrios son benéficos para A. tuberculosa? 2) Que tipo de función realizan en la hemolinfa? 3) Como integraron y si fueron “intencionalmente” introducidos en el sistema circulatorio? 4) A que concentraciones tienen un efecto benéfico? El análisis metageómico del tracto digestivo de un total de 3 muestras (TD) extraídas de 3 animales sanos fueron consideradas en este trabajo. El análisis por metagenómica de la microbiota asociada al TD de A. tuberculosa efectuado en este estudio es el primero realizado sobre un bivalvo que no sea una especie de ostra (King et al. 2012; Trabal et al. 2013). La abundancia del filo Proteobacteria en la microbiota cultivable de bivalvos ha sido reportado previamente en la ostra por otros estudios (Najiah et al. 2008; Green. 2010; Zurel et al. 2011; Fernández- Piquer et al. 2012). El filo Proteobacteria ha sido destacado en invertebrados marinos por 1) su capacidad a degradar la celulosa y el agar que son 2 componentes esenciales de la alimentación de los bivalvos, 2) estas especies son capaces de fijar el nitrógeno en el tracto gastrointestinal, y 3) por sus actividades antibacterianas (Prieur et al. 1990; Harris. 1993, Zehr et al. 2003; Newell. 2004; Defer et al. 2013; Fernandez et al. 2015). Los Firmicutes, Bacteroidetes, y Actinobacteria son también filos que se encuentran usualmente en los tractos digestivos de invertebrados (termitas que se alimentan del suelo) y cucarachas (Fall et al. 2007, Schauer et al. 2012) El filo Tenericutes ha sido detectado previamente en los aparatos digestivos de varias especies de ostras aunque en proporciones menores (King et al. 2012; Trabal Fernández et al. 2013). Sin embargo, la significancia fisiológica y ecológica de Tenericutes en el microbioma del TD es incierta. 38 En los bivalvos, el filo Spirochaetes agrupa a simbiontes no obligatorios generalmente asociados al estilete cristalino y pueden ser encontrados en abundancia en el aparato digestivo (Husmann et al. 2010). Este filo fue encontrado en las 3 muestras pero con una abundancia significativa (>a 1%) únicamente en la muestra TD3. Finalmente, la presencia de secuencias de cianobacterias indica que el proceso de depuración no ha permitido eliminar completamente el contenido digestivo en el TD1. Este proceso podría ser mejorado prolongado la depuración o eliminando más frecuentemente las heces para evitar la re asimilación de las mismas De forma general, de las 3 muestras analizadas, la muestra TD1 fue taxonómicamente muy diferente a las muestras TD2 y TD3. A nivel de clases, se observó diferencias modestas en la diversidad de las muestras TD2 y TD3 en comparación con los filos de estas mismas muestras. Dentro del filo Proteobacteria, en la muestra TD3 dominaba Gammaproteobacteria (86.7%) y TD2 contenía Gammaproteobacteria (91.3%) y Alfaproteobacteria 3.1%. En TD2 también se notaron la presencia de Mollicutes (3.8%) y Fusobacteria (1.2%). Sorprendentemente, la clase de Clostridia, conocida como indicadora de contaminación fecal fue fuertemente presente en TD1 (30.9%) y en TD3 (9.3%) Chang et al. 2008). La microbiota de TD1 se diferencia también de TD2 y TD3 por su mayor diversidad de clases y por su fuerte abundancia de Mollicutes (29.8%), Alphaproteobacteria (20.5%) y Bacilli (4.0%). Esta tendencia se continua con la prevalencia de Vibrio en TD2 (89,1%) y TD3 (57.8%) pero con la aparición del género Shewanella en TD3 (23.5%). Los Mycoplasma aparecen como el segundo género de importancia en TD1 y TD2 aunque están fuertemente presentes en TD1 (20.6%) y modestamente presentes en TD2. Infecciones por miembros del género han sido descritas en una variedad de moluscos bivalvos adultos como ostra, almejas, mejillones y 39 conchas (Cerastoderma edule) (Romalde et al., 2005). Recientemente King et al. (2012) evidenció la presencia masiva (>80%) de Mycoplasma en el intestino de ostras sanas C. virginica. El rol ecofisiológico de este Mollicutes en A. tuberculosa y bivalvos es incierto, con algunos reportes de parasitismo (Chen et al. 2011; Azevedo et al. 1993; Krol et al. 1999) y otros con algún tipo de comensalismo (King et al. 2012; Bano et al. 2007). Enterobacterias del género Echerichia están presente en un 16.8% y son otro potencial patógeno de bivalvo. El género Ehrlichia son bacterias parasitarias intracelulares que pertenecen al orden Rickettsiales y aunque son poco común en moluscos, su presencia fue mencionada en hemocitos de la almeja M. Mercenaria (Fries et al. 1991). La presencia de Psychrilyobacter (6.8%), Bacillus (2.8%) y Treponema completan la microbiota adherida del sistema digestivo de TD1. Así también, géneros de menor prevalencia como Thalassospira (2.6%), Pseudomonas (1.43%), Mangrovibacter (3.01%) y Synechococcus (1.3%) son observables en TD2 y TD3. En conjunto, los análisis en crudo (raw) de metagenómica del microbioma del TD de A. tuberculosa permitieron detectar 23 filos diferentes que abarcan 239 géneros (datos no mostrados). Sin embargo, un gran número de OTUs se encuentran presente en proporción realmente insignificante (menos de 0.1%) para poder tener un rol en la flora microbiana funcional del TD. El análisis de la microbiota única resalta a los géneros considerados como casuales o presentes por condiciones particulares. En este estudio los principales OTUs de géneros bacterianos encontrados en un solo individuo fueron: Shewanella (61.4%), Thalassospira (9.4%), Mangrovibacter (7.9%), Vibrio (5.9%), Pseudomonas (5.7%) y Bacillus (3.8%). Todos estos géneros cuentan con bacterias capaces de formar biopelículas (biofilm) lo que reduce la probabilidad que se encuentren presentes por casualidad por procesos de ingestión. King et al (2012) y Trabal et al. (2013) evidenciaron que existen variaciones en la composición microbiana entre especies de ostras y entre los sitios de muestreo. Estas variaciones resultan probablemente de diferencias en la composición del agua, de la dieta, posiblemente por enfermedades y eventualmente por diferencias genéticas entre individuales. Finalmente, la madurez del TD también influencia la composición de 40 la microbiota en organismos marinos (Harris 1993; Gatesoupe 1999; Paillard et al. 2004; Kesarcodi et al. 2012). En nuestro estudio, los individuos aparentemente sanos, fueron muestreados en el mismo sitio el mismo día y tenían un tamaño homogéneo (4.5 cm). Es importante resaltar también que a diferencia de las ostras, A. tuberculosa es un bivalvo móvil, con un comportamiento alimenticio filtrador pero también detritívoro mediante la resuspención del sedimento (Muñetón et al. 2010). Entonces, las diferencias interindividuales entre TD1 y TD2-TD3 resultan probablemente más de perturbaciones fisiológicas por la presencia de un parásito (Mycoplasma), de la migración de TD1 hacia el punto de muestreo, o de un comportamiento alimenticio diferente. Al contrario, si se focaliza sobre la microbiota compartida en las 3 muestras de TD, se evidencia que los vibrios son los principales residentes del TD de A. tuberculosa (72.3%), seguido por Clostridium (10.6%), Mycoplasma (8.8%), Ehrlichia 3.7% y Psychrilyobacter (2.5%). En conjunto estos resultados evidencian que la microbiota del TD de A. tuberculosa se encuentra compuesta en su mayoría por microbios potencialmente patógenos por el consumidor o parásitos para el animal (Mycoplasma y Ehrlichia). En efecto, varias especies de Vibrios, principalmente V. parahaemolyticus, V. cholera, V. vulnificus, V. mimicus, V. hollisae, han sido reportados por haber generado epidemias, muchas veces mortales durante las últimas décadas (Potasman et al. 2002). Los Clostridium son bacterias anaeróbica asociadas a eventos de diarreas e indicadores de contaminación fecal (Troiano et al., 2015; Pasquale et al. 2012; Chang et al. 2008). Estos resultados en conjunto indican que las conchas negras extraídas de Tumbes representan un riesgo de contaminación, posiblemente debido a la descarga parcial de las aguas residuales en los esteros. Esta contaminación ha causado que las conchas negras sean consideradas como un alimento a riesgo para el consumo humano (Fernández et al. 1977). A pesar de lo anteriormente expuesto, este marisco se comercializa vivo, directamente después de su extracción del medio y su principal forma de consumo a nivel nacional es como "ceviche", un aperitivo que se prepara con la sangre y la carne del bivalvo crudos, 41 con todas sus vísceras (Fernández, y Ryan 1983). Si es cierto que hasta la fecha no existe estudios epidemiológicos, esta práctica constituye claramente un riesgo de salud pública y por lo tanto es crítico desarrollar propuestas que permitan mejorar la calidad microbiológica de este marisco. Wong et al (1996) demostraron que la depuración de A tuberculosa permite reducir en un 99% la concentración de Enterobacterias por lo que esta práctica debería generalizarse. Los análisis filogenéticos globales de la microbiota cultivables de A. tuberculosa permitieron identificar 2 filos, correspondiente a 2 clases, repartidas en 5 géneros en la sangre (SG), mientras que se identificó solamente 1 género en el tracto digestivo (TD). El análisis filogenético de las secuencias por MG RAST utilizando la base de RDP permitió identificar 6 filos desagregados en 7 clases y 25 géneros en la SG, y 23 filos correspondientes en 34 clases y 239 géneros en el TD. Es importante resaltar que una gran proporción de géneros y clases encontradas por PGM™ son muy modestamente representados. Si es cierto que el número reducido de animales analizados por PGM™ (2 para SG y 3 para TD) limita la extrapolación de los resultados. Sin embargo, se observa que los resultados obtenidos por métodos microbiológicos clásicos y subsecuente taxonomía molecular concuerdan con los análisis de metagenómica al menos para los géneros más importantes. Este dato es particularmente importante dado que las bacterias aisladas fueron obtenidas de 15 individuos extraídos de la misma zona pero en diferentes momentos del verano 2015 y son entonces más representativos de la población de conchas negras de esta zona. Sorprendentemente, son las populaciones de bacterias cultivables del TD que fueron más subestimadas en comparación con los análisis de metagenómica a pesar de ser el tejido que albergaba mayores cantidades y diversidades de microorganismos. Aquello podría explicarse porque una fuerte proporción de la microbiota del TD no es cultivable o difícilmente cultivable (ej; Mycoplasma, Ehrlichia, Clostridium), por requerir condiciones abióticas específicas (pH, [O2], etc.) y; nutrientes (aportados por la alimentación o el animal). Aquello podría parcialmente remediarse con el uso de medios de cultivos específicos o 42 enriquecidos por ejemplo con tejidos de A. tuberculosa, y también mediante técnicas de co-cultivos. Desde un punto de vista filogenético, las cepas aisladas más frecuentemente en este estudio fueron similares a las reportadas previamente en tractos digestivos (Kueh y Chan 1985; Prieur et al. 1990; Olafsen et al. 1993; Harris 1993; Pujalte et al. 1999, Garnier et al. 2007, Najiah et al. 2008) o en hemolinfa (Olafsen et al. 1993; Garnier et al. 2007; Wendling et al. 2014). En el género Anadara, Ahmad et al. (2014) reportaron por orden de importancia la presencia de Vibrio, Neisseria, Alcaligenes, Pseudomonas y klebsiella sobre el manto de A. granosa, mientras que Romanevko et al. (2008) aislaron cepas de Psychrobacter Pseudomonas Halomonas Pseudoalteromonas, Aeromonas y Pantoea en el líquido inter valvar de A. broughtoni. Interesantemente este equipo no encontró cepas del género Vibrio. Este resultado plantea la posibilidad que las comunidades microbianas de la SG “corporal” y de la SG inter valvar puedan ser diferentes entre especies de Anadara. Para A. tuberculosa el estudio comparativo permitiría contestar esa pregunta y eventualmente entender por qué la concha negra “desangra” su líquido inter valvar en el medio cuando el animal está en condiciones de estrés. A la fecha, solo 3 trabajos han evaluado la diversidad microbiana de bivalvos mediante metagenómica. Lockmer et al. (2013) reportó que la microbiota de la hemolinfa de C. gigas sanas era dominada por los filos Proteobacteria y Bacteroidetes con una modesta participación del género Vibrio. Lamentablemente este autor no revela más información sobre la composición de géneros microbianos en animales sanos. El análisis de la microbiota de tractos digestivos de individuos sanos de C. corteziensis, C. sikamea y C. gigas mostró que los géneros Burkholderia y Escherichia/ Shigella eran los más importantes en las 3 especies evaluadas y que el género Vibrio y Pseudomonas eran poco abundantes (Trabal et al. 2013). Finalmente los resultados presentados por King et al (2012) son difícilmente comparables porque evalúan la microbiota presente en el fluido estomacal e intestinal de individuos no depurados y entonces no es posible distinguir la microbiota residente de la transitoria. 43 En conjunto, estos resultados muestran que la microbiota de la SG y del TD de A. tuberculosa es original frente a bivalvos modelos como las ostras. Ello se explica probablemente porque la concha negra es un animal móvil, con una alimentación detritívora/filtradora y porque viven en un ecosistema microbiano complejo, con parámetros abióticos altamente fluctuantes y cargas de materas orgánicas importantes (Xu et al. 2014). Lockmer et al. (2014) mostraron que ostras sobrevivientes a inyección de Vibrios patógenos (SMS) presentaban una microbiota similar al control mientras que en las muertas y moribundas dominaba fuertemente Arcobacter lo que sugiere que estos vibrios exógenos han sido eliminado y que estimularon a la microbiota residentes inactiva (Froelich et al. 2013). Este estudio y otros resaltan que si la estabilidad microbiana no es directamente relacionada a la resistencia, la baja diversidad microbiana coincide con mortalidades (Garnier et al. 2007; Chang et al. 2008; Green, 2010). Los resultados presentados en este trabajo indican que A. tuberculosa alberga una diversidad modesta de géneros pero que cohabitan muchas especies de Vibrios. La coexistencia de múltiples especies del género Vibrio en la SG y TD de A. tuberculosa plantea entonces el dilema que vibrios posiblemente benéficos podrían estimular indirectamente a cepas virulentas mediante Quórum Sensing (De Decker et al. 2013) o que podrían adquirir genes de virulencia con el tiempo. La virulencia y el carácter probiótico de las cepas de vibrios deberían ser evaluados experimentalmente para averiguar si estos vibrios son comensales, mutualistas o parásitos y si son residentes o transitorios? Existen pocos estudios del efecto probiótico de vibrios en moluscos. El principal antecedente corresponde a una serie de trabajos con la cepa C33 que muestra actividad inhibitoria frente a cepas patógenas (Avendaño y Riquelme. 1999). Esta cepa fue administrada a larvas de A. purpuratus utilizando un cultivo de microalgas (Isochrysis galbana) como vector y directamente para adultos (Riquelme 1999; Riquelme et al. 2000; Avendaño-Herrera et al. 2001). Finalmente, la inoculación de una mezcla de Vibrio sp. C33, Pseudomonas sp. 11 y Bacillus sp. B2, permitió realizar el cultivo larvario sin recurrir a antibióticos. Más recientemente, Defer et al (2013) evidenciaron que las bacterias circulantes de la 44 hemolinfa de la ostra con actividad antimicrobiana pertenecían exclusivamente a los géneros Vibrio y Pseudalteromonas. 45 6. CONCLUSIÓN  Se logró aislar y caracterizar molecularmente mediante la amplificación del gen 16S ARNr, 51 cepas de bacterias provenientes de la sangre y 25 cepas del tracto digestivo.  Mediante análisis metagenómico dirigido al gen 16S ARNr, se determinó una mayor diversidad microbiana en ambas muestras, correspondiente a 6 filos, 7 clases y 25 géneros en sangre y 23 filos, 34 clases y 239 géneros en tracto dgestivo.  El análisis metagenímico permitió visualizar la posible Share microbiota “microbiota nucleo” de A. tuberculosa en sangre y tracto digestivo, la cual está fuertemente dominada por vibrios, siendo el primer trabajo que resalta la aparente importancia de los vibrios en la microbiota nativa de bivalvos silvestres y sanos.  En menor porcentaje también pudo ser reportada la clase Bacilli, representada principalmente por los géneros Bacillus y Lactobacillus en la sangre de A. tuberculosa, los que pueden posiblemente tener un potencial probiótico.  En conjunto, los resultados mostraron que aunque se pierde un poco de diversidad, la flora microbiana cultivable dominante es bien reflejada en los resultados de metagenómica.  Este estudio fue original en varios aspectos; 1) es la primera descripción de la microbiota asociada a un bivalvo que no sea una ostra. 2) Es el primer estudio que considera tanto la microbiota del tracto digestivo y de la sangre, lo que permite tener una imagen del microbioma total de A. tuberculosa y 3) finalmente, es la primera vez que se compara la flora cultivable y no cultivable del mismo microbioma 46 7. RECOMENDACIONES  Considerar la inclusión de muestras de SG y de TD adicionales para enriquecer los resultados presentados aquí y mejorar la representatividad de la microbiota de las poblaciones silvestres de A. tuberculosa en Tumbes.  Un aspecto muy interesante sería realizar este tipo de análisis en diferentes momentos del año y en diferentes zonas. Aquello permitiría apreciar si existen cambios espacio-temporal en esta especie como han sido reportados recientemente en la hemolinfa de otros bivalvos como la Ostra  Implementar el estudio del microbioma de A. tuberculosa, correspondiente al análisis de la microbiota del agua, del suelo y del animal al momento del muestreo. Este tipo de trabajo permitiría correlacionar la participación del medio en la composición del animal así como evaluar la posible adquisición de estos microorganismos del entorno.  Direccionar estudios de gnotobiología e infecciones experimentales con las cepas aisladas en este estudio para evaluar el carácter probiótico-patógeno y así poder mejorar el entendimiento del rol de cada género en la fisiología de A. tuberculosa.  Implementar métodos de infección experimental en A. tuberculosa, para obtención de padrotes resistentes a infecciones bacterianas para la selección genética de poblaciones que provean larvas resistentes en condiciones de criadero. 47 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Abraham, C. 2009. The intestinal microbiome consists of the microorganisms that inhabit the gut. England Journal of Medicine. Allam, B., C. Paillard, and S. Ford. 2002. Pathogenicity of Vibrio tapetis, the etiological agent of brown ring disease in clams. Dis. Aquat. Org 48: 221– 23110. Allan D. 1995. 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Y de forma especial a mi abuela Manuela Pulache Castillo, por su incondicional apoyo, así también a mis seres queridos y amigos que se convirtieron en parte de mi familia. 60 AGRADECIMIENTO Un agradecimiento sincero al Programa de becas de maestría financiadas por el CONCYTEC (Consejo Nacional de Ciencia, tecnología e innovación tecnológica), por la oportunidad brindada. A la plana docente de la Universidad Nacional de Tumbes, con mención especial al profesor Oscar Mendoza Neyra, con quien se pudo desarrollar un proyecto Canon. Así como a los coordinadores de la maestria de biotecnología molecular Dra. Enedia Vierya Peña y Dr. Auberto Hidalgo Mogollón. Así también al equipo humano que conforma IncaBiotec SAC y Concepto azul, por permitirme desarrollar investigación científica en esta etapa de mi vida. Ph. D Virna Cedeño, Ph.D Emerik Motte M.Sc Juan Quimi y de forma especial PhD Dr de Estado. Eric Mialhe A mi asesor de maestria y amigo M.Sc Beoit Diringer, por la paciencia, orientación y apoyo brindado para culminar con éxito la presente investigación. A mis amigos y compañeros de trabajo, que me han permitido crecer de manera personal y acompañarme en el desarrollo de mi vida científica: José Gonzales, Karina Zapata, Ricardo Avellán, Angelita Ramos, Natali Ríos, Abraham Flores, Max Salvatierra, Cesar Solano, Fredy Fabian, Luis Llacsa, Eric Suares, Melitza Cornejo, Luis Aldo, Mercedes Oyola, Cinthya Cueva.