Universidad Nacional Mayor De San Marcos (Universidad del Perú, Decana de América) ESCUELA DE POSGRADO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNIDAD DE POSGRADO Identificación y caracterización molecular de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. insertados en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas. TESIS PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Bach. DORA GRACIELA QUISPE HUAMANQUISPE LIMA-PERU 2012 CONTENIDO I. INTRODUCCIÓN 1 1.2 Hipótesis general 2 1.3 Objetivos de la investigación 2 1.3.1 Objetivo General 2 1.3.2 Objetivos Específicos 2 II. ANTECEDENTES 3 2.1 El camote (Ipomoea batatas (L.) Lam) 3 2.1.1 Descripción y clasificación 3 2.1.2 Origen y distribución 5 2.1.3 Historia del cultivo 6 2.1.4 Importancia del cultivo 7 2.2 Agrobacterium spp. 8 2.2.1 Plásmidos Ti/Ri de Agrobacterium 10 2.2.2 Región del T-DNA 10 2.2.3 Mecanismo de infección de Agrobacterium 11 2.2.3.1 Reconocimiento de una célula vegetal susceptible 12 2.2.3.2 Unión de la bacteria a la célula vegetal 12 2.2.3.3 Inducción de la expresión de los genes Vir 13 2.2.3.4 Producción de una copia transferible del T-DNA 13 2.2.3.5 Transferencia del complejo-T a la célula vegetal 14 2.2.3.6 Integración del complejo-T en el genoma nuclear de la planta 15 2.2.3.7 Expresión de los genes del T-DNA 16 2.3 Transferencia Horizontal de genes (HGT) 18 2.3.1 HGT en bacterias 18 2.3.2 HGT en eucariotas 19 2.3.2.1 HGT en plantas 19 III. MATERIALES Y MÉTODOS 22 3.1 Materiales 22 3.1.1 Material biológico 22 i 3.1.2 Material bioinformático 22 3.1.3 Reactivos 23 3.1.4 Equipos de laboratorio 23 3.1.5 Software de análisis de datos 24 3.2.1 Métodos 24 3.2.1 Amplificación y clonación de los genes iaaM, iaaH, Acs, C y sus respectivas regiones intergénicas del T-DNA de camote mediante PCR. 24 3.2.1.1 Extracción de DNA genómico. 24 3.2.1.2 Diseño y optimización de iniciadores 25 3.2.1.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 25 3.2.1.4 Ligación y clonación de fragmentos de PCR 26 3.2.1.5 Análisis de restricción 27 3.2.1.6 Secuenciación y ensamblaje de los fragmentos obtenidos 28 3.2.2 Amplificación y clonación de secuencias nucleotídicas “no conocidas” mediante PCR- Genome Walker. 28 3.2.2.1 Diseño de iniciadores 28 3.2.2.2 Construcción de Bibliotecas Genome Walter 29 3.2.2.3 PCR- Touchdown 31 3.2.2.3.1 PCR primario 31 3.2.2.3.2 PCR secundario (Nested) 32 3.2.2.3 Ligación, clonación y secuenciación de los fragmentos de interés 32 3.2.3 Análisis Filogenético 33 3.2.3.1 Secuencia completa 33 3.2.3.2 Genes individuales 33 3.2.4 Hibridación por Southern Blot 33 3.2.4.1 Extracción de DNA genómico 34 3.2.4.2 Análisis de restricción y digestión del DNA genómico 35 3.2.4.3 Transferencia Southern 36 3.2.4.4 Preparación y marcaje de la sonda 37 3.2.4.5 Pre-hibridación e Hibridación 38 3.2.4.6 Lavados de estringencia 39 3.2.4.7 Detección y autoradiografías 39 ii IV. RESULTADOS 41 4.1 Amplificación y clonación de los genes iaaM, iaaH, Acs, C y sus respectivas regiones intergénicas del T-DNA de camote mediante PCR. 41 4.1.1 Extracción de DNA genómico 41 4.1.2 Diseño de iniciadores 41 4.1.3 Amplificación y clonación de los fragmentos de interés 43 4.1.4 Análisis de las secuencias obtenidas 46 4.2 Amplificación y clonación de secuencias nucleotídicas “no conocidas” mediante PCR- Genome Walker. 47 4.2.1 Diseño de iniciadores 47 4.2.2 Construcción de “Bibliotecas Genome Walker” 48 4.2.3 PCR Touchdown 49 4.2.4 Análisis de las secuencias obtenidas 52 4.3 Filogenia del T-DNA de camote 52 4.3.1 Secuencia nucleotídica completa 52 4.3.2 Análisis filogenético de los genes individuales del T-DNA de camote. 54 4.4 Hibridación por Southern blot 58 4.4.1 Extracción de DNA genómico 58 4.4.2 Análisis de restricción 59 4.4.3 Diseño y marcaje de las sondas 59 4.4.4 Detección del T-DNA 61 V. DISCUSIÓN 63 5.1 Identificación y caracterización del T-DNA de camote en I. batatas (L.) Lam (6x). 63 5.2 Identificación y caracterización del T-DNA de camote en especies silvestres cercanas a I. batatas (L.) Lam (6x) 66 5.3 Filogenia del T-DNA de camote 67 5.4 Posible rol del T-DNA de camote en el genoma de especies del género Ipomoea. 68 iii VI. CONCLUSIONES 70 VII. RECOMENDACIONES 71 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 72 IX. ANEXOS 84 iv INDICE DE FIGURAS Figura 1.- Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” 3 Figura 2.- Zonas productoras de camote en el Perú 8 Figura 3.- Plantas infectadas con especies del género Agrobacterium 9 Figura 4.- Mecanismo de infección de Agrobacterium 16 Figura 5.- Esquema de los eventos de ligación de los fragmentos obtenidos mediante PCR en el plásmido pGem-T Easy. 26 Figura 6.- PCR-Genome Walter 30 Figura 7.- Sistema de transferencia Southern 37 Figura 8.- Calidad del DNA genómico 41 Figura 9.- Gradiente de PCR para la amplificación del gen C 45 Figura 10.- Análisis de restricción con EcoRI 46 Figura 11.- Ensamblaje de secuencias correspondientes al T-DNA encontradas en el genoma de camote 46 Figura 12.- Mapa génico del T-DNA de camote resultante de los análisis de PCR 47 Figura 13.- Digestión enzimática de las Bibliotecas Genome Walter 49 Figura 14.- PCR primario Librería DraI 50 Figura 15.- PCR secundario Librería DraI 51 Figura 16.- Análisis de restricción con EcoRI 51 Figura 17.- Mapa génico del T-DNA de camote 52 Figura 18.- Organización genómica del T-DNA de camote comparada con especies de Agrobacterium más cercanas. 53 Figura 19.- Resultados del BLASTn de la secuencia completa del T-DNA de camote. 54 Figura 20.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 55 Figura 21.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas 56 Figura 22.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 56 v Figura 23.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen C del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 57 Figura 24.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen iaaH del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 57 Figura 25.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen iaaH del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 58 Figura 26.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen iaaM del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 59 Figura 27.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen iaaM del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. 60 Figura 28.- Calidad del DNA genómico 61 Figura 29.- Mapa génico del análisis de restricción y ubicación de la sonda diseñada 62 Figura 30.- Verificación de la sonda marcada 62 Figura 31.- Análisis de Southern blot de plantas de Ipomoea batatas (L.) Lam y especies silvestres cercanas digeridas con la enzima EcoRI e hibridadas con la sonda del gen C 3F-4R 64 vi INDICE DE TABLAS Tabla 1.- Iniciadores del Adaptador 29 Tabla 2.- Características de las enzimas de restricción usadas para la construcción de Bibliotecas Genome Walter 31 Tabla 3.- Iniciadores de la sonda 37 Tabla 4.- Lista de iniciadores empleados para la amplificación del T-DNA de camote 42 Tabla 5.- Resultados de las amplificaciones por PCR de los genes y regiones intergénicas del T-DNA 43 Tabla 6.- Condiciones de PCR para la amplificación de las regiones génicas e intergénicas del T-DNA 44 Tabla 7.- Iniciadores Genome Walter 48 Tabla 8.- Tamaño de los productos amplificados por PCR Genome- Walker 50 Tabla 9.- Resultados del BLASTn de la secuencia completa del T-DNA de camote. 54 vii RESUMEN La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. Este tipo de eventos no solo se restringe a bacterias, sino también parece tener un gran impacto en todos los grupos de organismos, incluyendo plantas y animales superiores, al menos en las primeras etapas de su evolución. Considerando la importancia de estos hallazgos y la escasa información acerca de HGT en eucariotas, el objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar a nivel molecular la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas. En el presente trabajo se evaluaron 87 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 6x = 90), 5 entradas tetraploides de Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 4x = 60) y 2 especies silvestres emparentadas: Ipomoea trífida e Ipomoea tabascana. De estas muestras se extrajo DNA, se realizó PCR y PCR-Genome Walker y se caracterizó molecularmente por pruebas de Southern blot los genes de interés. Los resultados obtenidos identificaron una región de 8123pb homóloga al T-DNA del plásmido Ti, que incluye a los genes: Acs, C, iaaH e iaaM y sus respectivas regiones intergénicas, insertada en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 6x = 90) cv Huachano a la cual se ha denominado “T-DNA de camote”, presente en su genoma en por lo menos 4 copias. Adicionalmente se identificó la presencia de una copia de este fragmento en una entrada tetraploide de Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 4x = 60). Este descubrimiento podría ayudar a elucidar el linaje evolutivo del género Ipomoea, sin embargo es necesario complementarlo con estudios de marcadores moleculares, morfológicos y de expresión de genes. Palabras claves: Transferencia Horizontal de genes (HGT), Ipomoea batatas (L.) Lam, Agrobacterium tumefaciens, T-DNA, PCR, PCR-Genome Walker, Southern blot. viii ABSTRACT Horizontal gene transfer (HGT) has been one of the most debated topics in evolutionary biology during the last two decades because it has significantly challenged our vision of the evolutionary history of genomes. This kind of events not only restricted to bacteria, but also seems to have a major impact on all groups of organisms, including plants and higher animals, at least in the early stages of its evolution. Considering the importance of these findings and the lack of information about HGT in eukaryotes, the objective of this thesis was to identify and characterize at the molecular level the presence of sequences homologous to the T-DNA from Agrobacterium tumefaciens into the genome of Ipomoea batatas (L.) Lam (2n=6x=90) and wild relatives. In this study we evaluated 87 cultivars of Ipomoea batatas (L.) Lam (2n=6x=90), 5 entries from Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 4x = 60) and two related wild species: Ipomoea trifida and Ipomoea tabascana. From these samples DNA was extracted, PCR and PCR-Genome Walker were performed and molecular characterized by Southern blot. The results identified a region of 8123pb homologous to T-DNA of the Ti plasmid of A. tumefaciens, which includes genes: Acs, C, iaaH e iaaM and their intergenic regions, inserted into the genome of Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 6x = 90) cv Huachano, to which has been called "T-DNA of sweetpotato", present in the genome in at least 4 copies. Additionally, we identified the presence of a copy of this fragment in an entry of Ipomoea batatas (L.) Lam (2n = 4x = 60). This discovery could help to elucidate the evolutionary lineage of the genus Ipomoea, however it is necessary be complemented with studies of molecular markers, morphological and gene expression. Key words: Horizontal gene transfer (HGT), Ipomoea batatas (L.) Lam, Agrobacterium tumefaciens, T-DNA, PCR, PCR-Genome Walker, Southern blot. ix I. INTRODUCCIÓN La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. En el caso de organismos procariotas como las bacterias, la adquisición de genes de otros individuos alejados filogenéticamente les ha permitido producir genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos cambiando por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). En eucariotas también se ha registrado la ocurrencia de eventos de HGT, los cuales incluyen a un gran número de genes provenientes de varios donadores en los rotíferos de la clase Bdelloidea (Gladyshev et al., 2008) o la transferencia de genes de la bacteria intracelular Wolbachia dentro del genoma de sus hospederos artrópodos (Hotopp et al., 2007). En plantas, el modelo mejor conocido sigue siendo el del género Agrobacterium cuyo mecanismo de infección involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. Sin embargo, el descubrimiento de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhognenes en el genoma de especies del género Nicotiana (White et al., 1983 y Furner et al., 1986), Daucus carota “zanahoria” (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis (Tepfer, 1982) han evidenciado que la ocurrencia de este tipo de eventos actúan como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Richardson y Palmer, 2007; Bock, 2010; Talianova y Janousek, 2011). La importancia de estos hallazgos incrementa la necesidad de realizar más investigaciones para entender el mecanismo de flujo horizontal de genes a través de bacterias en la evolución de plantas superiores, por lo que el presente trabajo de tesis pretende identificar y caracterizar la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas, con el fin de 1 evidenciar la ocurrencia de eventos de HGT en este género y el posible impacto de este hallazgo en su evolución. 1.2 Hipótesis general Teniendo en cuenta el hallazgo de secuencias homólogas al T-DNA de Agrobacterium spp. en el genoma de diferentes especies de plantas, consideramos que estas secuencias, se encuentran también en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y en especies silvestres relacionadas. 1.3 Objetivos de la investigación 1.3.1 Objetivo General:  Identificar y caracterizar a nivel molecular la presencia de secuencias homólogas al T-DNA de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas. 1.3.2 Objetivos Específicos:  Determinar la presencia de secuencias homólogas a genes del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) cv. Huachano “camote”.  Determinar la presencia de secuencias homólogas a genes del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en otros 86 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) “camote” pertenecientes a diferentes países donde crece este cultivo, en 5 entradas de Ipomoea batatas (L.) Lam (4x), Ipomoea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x).  Determinar el número de copias de los genes transferidos del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. a los genomas receptores. 2 II. ANTECEDENTES 2.1 El camote ( Ipomoea batatas (L.) Lam) 2.1.1 Descripción y clasificación El camote es una dicotiledónea rastrera perenne que pertenece a la familia de las Convolvuláceas (Convolvulaceae), posee hojas en forma de corazón o lobuladas palmeadas y flores simpétalas (Figura 1A). I. batatas (L.) Lam es una de las plantas cultivadas de mayor importancia de los más de 50 géneros y 1000 especies miembros de esta familia. Su sabor dulce, raíz tuberosa grande y alto contenido de almidón hacen de este cultivo una importante raíz reservante (Woolfe, 1992). Las hojas jóvenes y los brotes algunas veces son consumidos como verduras mientras que las raíces tuberosas largas y afiladas (Figura 1B) con cáscara lisa, de colores que varían entre el rojo, morado, marrón y blanco se comen crudos, cocidos o fritos. Los nombres más comunes para esta planta en el Perú y otros países de la región son batata, boniato, chaco, papa dulce, apichu (quechua) o kumara. A) B) Figura 1.- Ipomoea batatas (L.)Lam “camote” A) Planta de camote en el campo, B) Raíces tuberosas de color naranja. (http://www.everydayguide.com/how-to-grow-sweet-potatoes) 3 Clasificación taxonómica del camote (http://plants.usda.gov/java/Classification Servlet?source=profile&symbol=IPBA2&display=3): División: Magnoliophyta Subdivisión: Angiospermae Clase: Magnoliopsida Subclase: Asteridae Orden: Solanales Familia: Convolvulaceae Género: Ipomoea L. Serie: Batatas Especie: Ipomoea batatas (L.) Lam Esta especie fue descrita por Linneo en 1753 como Convolvulus batatas. Sin embargo, en 1791, Lamarck clasificó esta especie dentro del género Ipomoea basándose en la forma del estigma y a la superficie de los granos de polen. Por lo tanto, el nombre fue cambiado a Ipomoea batatas (L.) Lam (Huamán 1992). El número de cromosomas en la planta de camote es 2n = 6 x = 90. Esto indica que es una especie hexaploide con un número básico de cromosomas x = 15. Sin embargo, también se ha registrado para esta especie entradas tetraploides 2n = 4x = 60, a las cuales se les ha denominado camotes (4x) (Bohac et al., 1993). En el camote, tanto el origen de su poliploidía como la identidad de su ancestro silvestre todavía se encuentran en debate. Sin embargo, se han propuesto hipótesis como la de Zhang et al., (2001) que sugieren que el camote tiene una constitución genética alo-auto-hexaploide (tetradisómica) con dos 4 genomas diferentes (B1B1B2B2B2B2), ello basado en el estudio de microsatélites “SSRs”, (Short Sequence Repeat). 2.1.2 Origen y distribución Los restos arqueológicos de camotes más antiguos en el mundo han sido los encontrados en las cuevas del cañón de Chilca (Perú) con una antigüedad de 8,000 años (Woolfe, 1992). El análisis de sus gránulos de almidón indica que aunque fueron significativamente más pequeños en tamaño en comparación a los actuales cultivares, ellos son definitivamente de la especie I. batatas (L.) Lam (Perry, 2002). Los primeros estudios basados en el análisis de caracteres morfológicos y el número de especies silvestres del género Ipomoea, postularon que el centro de origen del camote fue algún lugar de la región comprendida entre la península de Yucatán en México y la desembocadura del río Orinoco en Venezuela (Austin, 1977; 1987). Asimismo, el camote cuenta con centros secundarios de diversidad genética (áreas geográficas donde el cultivo evolucionó separadamente de sus ancestros) como la región comprendida entre Perú y Ecuador (Zhang et al., 1998); y Papua Nueva Guinea, Indonesia y Filipinas (Carey et al., 1992). El desarrollo posterior de marcadores moleculares como los RFLPs (Restricted Fragment Length Polymorphisms) en los años 80, los RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) y los SSR en los años 90, han dado nuevas luces para resolver el complejo tema del origen y la domesticación del camote. En este sentido, trabajos basados en marcadores moleculares (RFLP, RAPD, y SSR) confirmaron la relación filogenética cercana entre I. batatas (L.) Lam y la especie silvestre I. trífida (Jarret et al.,1992; Jarret y Austin, 1994; Buteler et al., 1999), previamente reportada con el análisis de datos morfológicos (Austin, 1977, 1987). Otras evidencias basadas en el análisis de restricción de DNA cloroplástico fueron más lejos e indicaron que I. trífida es probablemente uno de los antecesores de I. batatas (L.) Lam (Huang y Sun, 2000). Adicionalmente, estudios basados en la secuencia génica de la β-amilasa, un gen nuclear bastante conservado, sugirieron que I. batatas (L.) Lam, I. trífida e I. tabascana forman un grupo monofilético, es decir descienden del mismo ancestro (Rajapakse et al., 2004). 5 Trabajos recientes mediante citogenética molecular usando FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), llevados a cabo en este cultivo han afianzado los resultados previos acerca de la relación filogenética cercana entre I. trífida e I. batatas (L.) Lam. Además, también se ha observado que la organización cromosómica de esta última está más relacionada a I. trífida que a I. tabascana. Las investigaciones basadas en esta técnica concluyen que más de un progenitor está involucrado en la filogenia del camote hexaploide. Una hipótesis alopoliploide es mantenida con una composición formada por al menos dos genomas diferentes, una de una especie cercanamente relacionada y otra de una pariente distante (Srisuwan et al., 2006). 2.1.3 Historia del cultivo El camote fue ampliamente cultivado a lo largo de América Central y del Sur antes del primer contacto europeo. Este cultivo fue una de las primeras plantas introducidas a Europa después de los viajes de Colón en 1492. De Europa los exploradores portugueses en el siglo XVI expandieron este cultivo al África, India, Sureste de Asia y las Indias Orientales, alcanzando luego Nueva Guinea, las islas del Pacifico Oeste, China y Japón (Rajendran, 1990). El origen del cultivo en el Pacífico ha sido un enigma de larga data. Restos carbonizados de camotes de las islas de Pascua y de Hawaii son anteriores al primer contacto europeo. Por lo que se sugiere que el camote pudo haber sido distribuido a Nueva Zelanda 1150-1250 años después de Cristo. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la distribución del camote a lo largo de las islas del Pacífico se llevó a cabo por los viajeros peruanos o polinesios. Barrau (1957 citado por Yen, 1974) y Yen (1982) han propuesto la famosa hipótesis “tripartita” que intenta explicar cómo ocurrió la introducción del camote en las islas del Pacífico. Ésta se basa en tres posibles vías:1) La línea kumara, que consiste en una introducción prehistórica de clones de áreas costeras de América del Sur llevada a cabo por viajeros peruanos o polinesios. 2) La línea batatas, mediante el cual los exploradores portugueses transfirieron cultivares de las Indias Occidentales a África, India y las Indias Orientales, y 3) La línea kamote, donde los galeones españoles propagaron clones de camote de México a las Filipinas a través del comercio en el Pacífico. 6 Rossel et al., (2000), basados en el análisis de marcadores AFLPs, evidenciaron la escasa relación entre el germoplasma de Perú-Ecuador y el de Oceanía, sugiriendo que esta región pueda no ser el origen del material del Pacífico. Por lo que la línea camote sea la más probable fuente de introducción. 2.1.4 Importancia del cultivo La importancia de este cultivo radica en su valor nutritivo. Las raíces reservantes poseen un alto contenido de carbohidratos y β-caroteno (un precursor de la vitamina A), y sus hojas se caracterizan por ser ricas en proteínas. Las raíces también contienen vitamina C, complejo B y E así como potasio, calcio y hierro. Adicionalmente, los camotes de pulpa morada contienen antioxidantes tales como las antocianinas (Bradshaw, 2010) Además de su valor nutricional, el camote es el séptimo cultivo más importante en el mundo, con una producción anual de alrededor de 110 Mt (millones de toneladas) y una superficie cultivada de 9 millones de hectáreas (FAOSTAT, 2009). En la mayoría de los países en desarrollo, se trata de un cultivo de pequeños agricultores tolerante a un amplio rango de condiciones edáficas y climáticas. Una de las principales características de este cultivo es que se adapta desde el nivel del mar hasta los 2,500 metros de altura, razón por la cual se ha convertido en el alimento básico de las comunidades que viven en las tierras altas de Uganda, Ruanda y Burundi en el este de África y en Papua Nueva Guinea. Los países asiáticos, particularmente China, son los principales productores, abarcando el 80% de la producción mundial (FAO, 2006). En América Latina, destacan en producción Brasil, Argentina, Perú, Cuba y Haití (FAO, 2009). En el Perú, la mayor zona de producción de camote es el departamento de Lima en donde se concentra el 70% de la superficie cultivada; siendo las provincias de Huaral (800 Ha) y Cañete (3,500 Ha) las principales zonas productoras de camote, las cuales ofertan al mercado capitalino 120 mil toneladas métricas (TM) anuales. Los valles del norte chico Huacho, Barrranca y Pativilca, poseen menor superficie de siembra (700 Ha) y aportan alrededor 12 mil TM para los mercados de Lima. Los valles costeros de Ancash, cultivan aproximadamente 7 1,500 hectáreas. En cambio, los valles costeros de los departamentos de Lambayeque y la Libertad registran una superficie de siembra de 2,300 Ha. En los valles de Ica y Arequipa cultivan 1000 Ha. (INIA, 2006) (Figura 2). Figura 2.- Zonas productoras de camote en el Perú (INIA, 2006). Los agricultores usan sólo esquejes de campos de producción en vez de semilla y así los costos del material propagador son también mínimos (Karyeija et al., 1998). A pesar de estas condiciones, este cultivo produce cantidades notables de biomasa, a menudo produciendo más energía comestible que cualquier otro cultivo principal (CIP, 1996). Por estas razones, el camote, es considerado como un cultivo ideal para una agricultura de subsistencia que pueda reducir los problemas de hambruna y malnutrición en muchos lugares del mundo. 2.2 Agrobacterium spp. Agrobacterium es un género de bacterias Gram-negativa que usan la transferencia horizontal de genes para causar diversas enfermedades neoplásicas en plantas, las cuales incluyen: “Agalla de la corona” (Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium vitis), “raíces fibrosas” (Agrobacterium rhizogenes) y “agalla de caña” (Agrobacterium rubi) (Escobar y Dandekar, 2003). El mecanismo de infección de Agrobacterium es un fenómeno natural en el cual la bacteria transforma genéticamente células de la planta infectada. El 8 proceso de transformación depende de la presencia de un plásmido en la bacteria, de 200-800 Kb (Zaenen et al., 1974; Costantino et al., 1994; Broothaerts et al., 2005), llamado pTi (plásmido inductor de tumores) en el caso de A. tumefaciens y A. vitis, o pRi (plásmido inductor de raíces) en el caso de A. rhizogenes. Estos plásmidos llevan un fragmento de DNA denominado DNA de transferencia “T-DNA”, el cual es transferido a la célula vegetal; y los genes de virulencia (Vir), los cuales codifican factores que actúan en trans necesarios para el procesamiento del T-DNA (Sheng y Citovsky, 1996; Zhou y Christie, 1999). Este proceso de transferencia de genes ha sido ampliamente estudiado no sólo desde el punto de vista fitopatológico, sino también por su aplicación en el campo de la biotecnología, como método para introducir genes de interés en plantas (Tzfira y Citovsky, 2003; Llop 2003; Gelvin 2009); siendo las especies mejor caracterizadas de este género: Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes (Figura 3). A) B) Figura 3.-Plantas infectadas con especies del género Agrobacterium. A) Agrobacterium tumefaciens y B) Agrobacterium rizhogenes. (www.forestryimages.org/images/768x512/5357075.jpg) 2.2.1 Plásmidos Ti/Ri de Agrobacterium La mayoría de los genes involucrados en la formación de tumores de Agrobacterium están codificados en plásmidos (Van Larebeke et al., 1974; Hooykaas et al., 1977; Costantino et al., 1980; Holsters et al., 1980). 9 En el género Agrobacterium el plásmido más característico es el Ti y la mayoría de los genes que contiene juegan papeles directos o indirectos en la tumorogénesis. Este plásmido tiene un tamaño de entre 150 a 250 Kb (Zaenen et al., 1974; Wood et al., 2001), aunque se han encontrado plásmidos Ti de hasta 500 Kb (Unger et al., 1985). La composición media en G+C del plásmido es del 55%, aunque algunas regiones son más ricas en A-T, como el T-DNA. Se han contabilizado hasta 198 ORFs (Open reading frame) y probablemente todas codifican proteínas funcionales (Wood et al., 2001). Hay una gran diversidad de plásmidos Ti y se clasifican según el tipo de opina que sintetizan. Los más estudiados son los plásmidos de nopalina/agrocinopina (como los pTiC58, pTiT37) y los plásmidos de octopina/manopina (pTiB6, PtiAch5, pTiR10 y pTi15955) (Currier y Nester, 1976; Depicker et al., 1977). Los plásmidos de tipo octopina tienen en común unas 65 Kb respecto al pTiC58 (Engler et al., 1981). La organización genética del plásmido Ti puede verse como una disposición en mosaico donde las regiones están más o menos bien conservadas (Tzfira y Citovsky, 2008). Globalmente, presenta una estructura modular con genes de funciones similares agrupados juntos. Así, podemos definir cinco componentes: La región del T-DNA, que codifica las secuencias que son transferidas a la planta huésped; la región vir, que dirige el procesamiento y transferencia del T-DNA; los loci tra y trb, que dirigen la transferencia conjugativa del plásmido Ti y que, a diferencia de los otros componentes, no están agrupados sino separados por 60 Kb; la región rep que se requiere para la replicación del plásmido Ti; y los genes que dirigen la adquisición y el catabolismo de las opinas (Zhu et al., 2000). 2.2.2 Región T-DNA Es el segmento de DNA que se transfiere desde la bacteria a la célula vegetal (Chilton et al., 1977). A diferencia de los elementos transponibles que pueden moverse repetidamente, el T-DNA una vez transferido permanece estable, y no codifica por sí mismo los productos que median su transferencia (Joos et al., 10 1983; Leemans et al., 1982; Zambryski et al., 1983). El tamaño del T-DNA varía según el tipo de plásmidos, pero sólo los extremos, llamados bordes, se reconocen durante el proceso de transferencia (Wang et al., 1984; Peralta y Ream, 1985). Estos bordes están formados por 25 pb que flanquean la región del T-DNA como repeticiones directas (Zambryski et al., 1982). Estas secuencias borde dirigen la transferencia de forma polar, en dirección derecha-izquierda, determinada por la orientación de los extremos repetidos, siendo el borde derecho imprescindible para la formación del tumor (Joos et al., 1983; Shaw et al., 1984; Wang et al., 1984). En algunas cepas de Agrobacterium un segundo T-DNA puede estar presente (White et al., 1985). En este caso los dos T-DNAs (TL-DNA ó T-DNA izquierdo y TR-DNA ó derecho) son llamados T-DNA “split” (Veena y Taylor, 2007). El tamaño de ambos TL-DNA y TR-DNA es de aproximadamente 15-20 Kb y son transferidos e integrados independientemente en el genoma de la planta hospedadora (White et al., 1985). 2.2.3 Mecanismo de infección de Agrobacterium Los descubrimientos más importantes del mecanismo de infección se basan en las siguientes características: la tumorogénesis requiere la transferencia de fragmentos de DNA oncogénico a células de la planta infectadas; este proceso evolucionó a partir de un sistema de transferencia conjugativa; los genes que dirigen este proceso se expresan en respuesta a señales químicas que libera el huésped. Se han descrito al menos siete pasos en la inducción tumoral: 1) Reconocimiento de una célula vegetal susceptible, 2) Unión de la bacteria a la célula vegetal, 3) Inducción de la expresión de los genes vir, 4) Producción de una copia transferible del T-DNA, 5)Transferencia del complejo-T a la célula vegetal, 6) Integración del complejo-T en el genoma nuclear de la planta, y 7) Expresión de los genes que contiene el T-DNA (Llop, 2003) (Figura 4). Mientras que durante los pasos iniciales de la transferencia se utilizan procesos bacterianos bien conservados, en los pasos finales se requieren otras rutas relacionadas con el desarrollo y crecimiento de la planta. 11 2.2.3.1 Reconocimiento de una célula vegetal susceptible Desde los inicios del estudio de este proceso se comprobó que la bacteria necesita heridas en la planta para causar la infección. Este hecho se podría explicar de forma simple asumiendo que las células de plantas dañadas presentan una barrera física menor a la penetración e infección que las células no dañadas, al poseer éstas las paredes celulares intactas. Sin embargo, se sabe que las células dañadas secretan compuestos fenólicos de bajo peso molecular que son reconocidos de forma específica como moléculas señal. Agrobacterium migra a través de una gradiente de concentración de estos compuestos hacia la herida. Estos compuestos fenólicos son principalmente acetosiringona (AS) e hidroxi- acetosiringona (OH-AS) (Llop, 2003). Estas moléculas son similares a productos del metabolismo del fenilpropanoido, una de las rutas metabólicas que proporciona la mayoría de los metabolitos secundarios de las plantas, que conduce a la producción de ligninas y flavonoides. La lignina es el mayor componente de la pared celular y proporciona una barrera física contra la invasión por patógenos, mientras que los flavonoides incluyen una variedad de compuestos que producen aroma, color y sabor, así como moléculas antimicrobianas específicas como las fitoalexinas. Agrobacterium, por tanto, usa estos compuestos como señales de la presencia de una planta potencialmente susceptible. 2.2.3.2 Unión de la bacteria a la célula vegetal Una vez que Agrobacterium llega a la herida se produce una débil unión inicial, de forma polar y que es reversible (Matthysse, 1983). Posteriormente, las bacterias elaboran fibrillas de celulosa que las anclan firmemente a la superficie del huésped (Matthysse et al., 1981). Los genes cromosómicos de virulencia chvA, chvB y pscA son los que están implicados en esta unión. La unión bacteriana a la célula vegetal es saturable y, probablemente, está mediada por una molécula sensible a la proteasa que se encuentra en la superficie de la célula vegetal. Dos proteínas de la pared celular se han propuesto como responsables de la unión: una proteína similar a la vitronectrina (Wagner y Matthysse, 1992) y una proteína de unión ricoadhesina (Swart et al., 1994). 12 2.2.3.3.1 Inducción de la expresión de los genes Vir Los genes Vir están organizados en 6 locis mono o policistrónicos (VirA: 1ORF, VirB: 11ORFs, VirR: 2ORFs, VirD: 5ORFs, VirE: 2ORFs, VirG: 1ORF). Se ha demostrado que algunas cepas de Agrobacterium contienen genes Vir adicionales tales como VirF, VirH y tzs. Estos genes no son esenciales para el procesamiento del T-DNA pero si incrementan la virulencia y el rango de hospederos de la bacteria (Winans, 1992). Cuando los compuestos fenólicos de bajo peso molecular están a una concentración de 10-5 M y el pH se encuentra entre 5.0 y 5.8 se activan los genes vir. La acidez es necesaria para protonar los compuestos fenólicos y así incrementar su permeabilidad de membrana. Esta inducción es un proceso lento que tarda en llegar a los máximos niveles de expresión de 8 a 16 horas. Todos los inductores actúan sobre el operón VirA cuyo producto se autofosforila y, directa o indirectamente, este grupo fosfato de alta energía es transferido a la proteína VirG que pasa a su forma activa y estimula la transcripción del resto de genes del regulón Vir (Jin et al., 1990). 2.2.3.4 Producción de una copia transferible del T-DNA Una vez que los genes vir empiezan a transcribirse se produce el proceso de síntesis de la cadena-T. Las proteínas codificadas por el operón virD reconocen las secuencias terminales que delimitan el T-DNA (Yanofsky et al., 1986). La proteína VirD1 pasa el DNA superenrollado a la forma relajada (Ghai y Das, 1989) y, a continuación, VirD2 corta la cadena de DNA inferior por los extremos y se une covalentemente, a través de un residuo de tirosina 29, al extremo 5’ de cada cadena rota. Mientras la cadena superior permanece en forma de dúplex, aproximadamente la mitad de las inferiores están en forma lineal de cadena simple y se denominan cadena-T (Stachel et al., 1986). Se piensa que la cadena-T se forma por desplazamiento durante la síntesis del DNA mediante el mecanismo de círculo giratorio “rolling-circle” que se inicia a partir del extremo 3’ de cada borde derecho. La proteína VirD2, que está fuertemente unida a la cadena-T, le confiere polaridad asegurando que el extremo 5’ sea el que entre primero en el núcleo de la célula vegetal. Este complejo ácido nucleico/proteína 13 está compuesto por una única molécula VirD2 -que actúa de piloto gracias a sus secuencias de localización nuclear (NLS, nuclear signal localization)- unida a un DNA de cadena simple que se denomina complejo-T (Zupan et al., 2000). 2.2.2.5 Transferencia del complejo-T a la célula vegetal En este proceso un segmento del DNA específico, el complejo-T, es reconocido y movilizado. Esta copia debe ser transportada hasta la membrana bacteriana, atravesar en primer lugar la membrana y pared bacteriana y, posteriormente, la pared celular y la membrana de la célula vegetal. Una vez en la célula vegetal debe moverse a través del citoplasma y cruzar la membrana nuclear hasta llegar al núcleo de la célula vegetal. VirD2 guía a la cadena-T a través del pilus compuesto por las proteínas VirB y la proteína VirD4. La proteína VirE2 también parece jugar un papel importante como guía del complejo-T ya que posee, como VirD2, secuencias NLS que median en su transporte del citoplasma al núcleo de la célula vegetal (Zupan et al., 2000). Esta proteína se une firme y cooperativamente a ácidos nucleicos de cadena simple formando filamentos cilíndricos enrollados. Se creyó en un principio que VirE2 se unía al complejo-T dentro de la bacteria pero se han encontrado evidencias genéticas que demuestran que se transfieren de forma separada a la célula vegetal, formando un complejo en su citoplasma (Gelvin, 2000). Por tanto, ambas proteínas VirD2 y VirE2 dirigen la cadena-T hacia el núcleo de la célula vegetal, pero también pueden hacerlo en levaduras o en células animales (Guralnick et al., 1996; Relic et al., 1998). En el transporte hacia el núcleo también están implicadas diferentes proteínas de las plantas como la α-carioferina (Ballas y Citovsky, 1997) o la ciclofilina (Deng et al., 1998) que interaccionan con las secuencias NLS de las proteínas Vir. Las ciclofilinas parece que mantienen a la proteína VirD2 en una conformación adecuada para la transferencia, mientras el complejo-T se mueve por el citoplasma. En muchos aspectos la transferencia del complejo-T recuerda a la transferencia conjugativa del DNA plasmídico y se ha comprobado que existen grandes similitudes de secuencia entre las proteínas Vir y las Tra (Kado, 1994; 14 Lessl et al., 1994), lo que sugiere que el aparato de transferencia del DNA evolucionó a partir del sistema de transferencia conjugativa. 2.2.2.6 Integración del complejo-T en el genoma nuclear de la planta. Esta etapa del proceso es poco conocida. En principio, el T-DNA se integra en el cromosoma vegetal por recombinación ilegítima, que es la forma mayoritaria de integración de DNA foráneo en plantas (Gheyssen et al., 1991). Es probable que la mayor parte del T-DNA transferido al núcleo no se integre establemente, ya que el nivel de expresión transitoria es muy superior comparado con la estable (Nam et al.,1997). El T-DNA entra en el núcleo como una molécula de cadena simple (Gelvin et al., 2000). Se desconoce si se integra en una zona del DNA vegetal localmente desnaturalizado como cadena simple y después se sintetiza la segunda cadena o si pasa a ser de doble cadena antes de la integración. El punto de integración parece que es al azar y que no hay requisitos de secuencia específicos en el genoma vegetal para que se produzca (Mayerhofer et al., 1991), aunque se ha descrito que la integración se produce preferentemente en zonas con la secuencia de DNA en estado de transcripción activa (Herman et al, 1990). Además de los componentes bacterianos, hay varias proteínas que han sido encontradas esenciales para la integración del T-DNA en las células de la planta, como las histonas (H2A) (Tenea et al., 2009), y las enzimas para la recombinación y reparación del DNA (DNA ligasa IV) (Mysore et al., 2000; Friesner et al., 2003). 15 Figura 4.- Mecanismo de infección de Agrobacterium. 1) Reconocimiento de una célula vegetal susceptible, 2) Unión de la célula vegetal a la bacteria, 3) Inducción de la expresión de los genes Vir, 4) Producción de una copia transferible delT-DNA, 5) Transferencia del complejo T a la célula vegetal, 6)Transporte del complejo T en el citoplasma de la célula vegetal, 7), 8) y 9) Entrada del complejo T al núcleo, y 10) Integración del T-DNA en el genoma nuclear de la planta. (Modificado de Tzfira y Citovsky, 2008). 2.2.2.7 Expresión de los genes del T-DNA Una vez que las copias del T-DNA se insertan establemente en el genoma vegetal, se transmiten a las células hijas mediante meiosis o mitosis, comportándose como un locus más de la planta y confiriéndole el fenotipo transformado a las células hospederas (Spielman y Simpson, 1986). Una vez integrado, los genes del T-DNA se expresan en altos niveles ya que contienen señales de transcripción eucariota (Chilton et al., 1980; Willmitzer et 16 al.,1983). De este modo, se transcriben los dos grupos de genes caracterizados: los oncogenes (onc) y los genes de síntesis de opinas (ops). Los oncogenes son los responsables de la síntesis anormal de fitohormonas, principalmente auxinas y citoquininas, que a su vez permiten una diferenciación anormal de las células y provocan la aparición del tumor, mientras que los genes de síntesis de opinas son aquellos que codifican enzimas que hacen que la planta produzca aminoácidos especializados llamados opinas, los cuales son una fuente de energía específica para la bacteria (Hong et al., 1997). En la naturaleza, los onc expresados por Agrobacterium son: • iaaM e iaaH, quienes dirigen la conversión del triptófano vía indolacetamida a la auxina “ácido indolacético” (Inzé et al., 1984; Schroder et al., 1984; Thomashow et al.,1984). • ipt o tmr cuyo producto condensa isopentenil pirofosfato y AMP, que convierten en isopentenil-adenosina, una citoquinina (Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984). • El producto del gen 5, el cual dirige la síntesis de indol-3-lactato, un análogo antagonista de auxinas, y que además limita su producción por debajo de los niveles tóxicos de esta hormona (Körber et al., 1991). • El gen 6a, el cual codifica una permeasa que transporta las opinas a través de membranas (Messens et al., 1985) y, • El gen 6b , encargado de aumentar la sensibilidad de las células de la planta a las fitohormonas de forma aún desconocida (Hooykaas et al., 1988), pero que puede estar involucrado en la respuesta hormonal (Wabiko y Minemura, 1996). El segundo grupo de genes transferidos, los ops dirige la producción de opinas, y dependiendo del tipo de plásmido se han descrito distintos genes (Tempé y Goodman, 1982; Ellis et al., 1984; Dessaux et al., 1986), aquí mencionamos alguno de ellos y las enzimas que codifican: • nos – nopalina sintetasa • acs – agrocinopina sintasa • ocs – octopina sintetasa 17 • ags – agropina sintetasa • mas 1’ y mas 2’ – manopina sintetasa 2.3 Transferencia Horizontal de genes (HGT) Los genes son regularmente transmitidos verticalmente dentro de un linaje, de una generación a la próxima, sin embargo también pueden ser intercambiados entre linajes por transferencia horizontal de genes (HGT) (Denker et al., 2008). La HGT, también conocida como transferencia de genes lateral (LGT), es un proceso en el que un organismo transfiere material genético a otra célula que no es descendiente. 2.3.1 HGT en bacterias La HGT es común entre las bacterias, éstas han obtenido una fracción significativa de su diversidad genética a través de la adquisición de secuencias de genes de otras bacterias alejadas filogenéticamente. La transferencia horizontal de genes produce genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos, en los que cantidades importantes de DNA son incorporadas y eliminadas del cromosoma. Las transferencias laterales han cambiado, por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas, promoviendo la diversificación y especiación microbiana. Por medio de la transferencia horizontal de genes, las bacterias son capaces de adquirir resistencia a diferentes antibióticos, capacidades virulentas, y diferentes propiedades metabólicas que les permiten explorar nuevos hábitats (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). Existen tres mecanismos fundamentales mediante los que las bacterias son capaces de adquirir nuevos fragmentos de DNA: transformación , mediante la cual la bacteria capta DNA desnudo del entorno, lo cual permite la transmisión de material genético entre especies muy distantes; transducción , mecanismo por el cual un bacteriófago transfiere fragmentos de DNA de una bacteria a otra; y conjugación , el único proceso que requiere contacto físico entre las dos bacterias que se transfieren así el material genético (Madigan et al., 1999). 18 2.3.1 HGT en eucariotas La transferencia de genes bacterianos a genomas de eucariotas parece estar facilitada por endosimbiontes, desde las mitocondrias y plastos (Gupta, 2000), pasando por los bien conocidos procesos de transmisión bacteriana a algunos hongos como Saccharomyces o la bacteria Wolbachia pipientis en la línea germinal de algunos eucariotas (Nikoh et al., 2008). En el 2007, Hotopp et al., examinaron los genomas de los hospedadores de la bacteria Wolbachia pipientis para evidenciar eventos de transferencia horizontal de genes entre estos organismos. Los resultados experimentales obtenidos confirman la transferencia horizontal en los genomas de cuatro insectos y cuatro nematodos, en cantidades que oscilan desde pequeñas inserciones (menos de 500 pares de bases) hasta el genoma entero del parásito (más de 1 megabase). Además, se pudo conocer que algunos de estos genes de Wolbachia son transcritos en las células eucariotas que carecen de endosimbiontes, lo que indica que los genes transferidos horizontalmente son heredables, proporcionando así un mecanismo para la adquisición de nuevos genes y funciones que puede representar un importante impulso evolutivo. En concreto, de los 1206 genes de Wolbachia, al menos 28 están activos después de su inserción en el genoma de la mosca Drosophlia ananassae, aunque aún no está claro si codifican proteínas. También se ha encontrado evidencias de transferencia horizontal de genes bacterianos a rotíferos de la clase Bdelloidea, tal como lo demuestran los resultados obtenidos por Gladyshev et al., 2008. En este trabajo se reporta la presencia de genes provenientes de diferentes organismos, tales como bacterias, hongos y plantas, en el genoma de estos rotíferos, los cuales parecen concentrarse a lo largo de las regiones teloméricas con algunos elementos genéticos móviles. Algunos de estos genes foráneos son defectivos mientras que otros se mantienen intactos y se transcriben; la captura y la asimilación funcional de estos genes exógenos pueden representar una fuerza importante en la evolución de los rotíferos de la clase Bdelloidea. 2.3.1.1 HGT en plantas En plantas, el modelo mejor conocido de transferencia horizontal de genes es el del género Agrobacterium. En las primeras investigaciones de 19 transformación de plantas por este género muchos investigadores creyeron que no había homología significante entre las secuencias del T-DNA y el genoma de la planta. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que el genoma de algunas plantas contienen secuencias similares a las del T-DNA de Agrobacterium. De esta manera, White et al., 1983 detectaron una región homologa al T- DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhogenes en el genoma de Nicotiana glauca y llamaron a este DNA, T-DNA celular (T-DNAc). Posteriormente, Furnert et al., 1986 confirmaron este descubrimiento analizando diferentes variedades de N. glauca y confirmaron su presencia en por lo menos cuatro especies más: N. Otophora, N. tomentosiformis, N. tomentosa y N. benavidesii. Ellos determinaron la secuencia de la región rolB-C e identificaron dos genes rol, llamados NgrolB y NgrolC (Ng por N. glauca) y además sugirieron que el T-DNAc fue resultado de la infección temprana de Agrobacterium en la evolución del género Nicotiana. Diez años más tarde, Meyer et al.,en 1995 amplificaron del genoma de N. tabacum (cv. Havana 425) secuencias homólogas a los genes pRiA4 rolB, rolC y orf13 (llamados trolB, trolC y torf13, respectivamente). Ellos también amplificaron las regiones intergénicas de estos genes y sugirieron que el genoma del tabaco posee al menos una copia de los loci rolB, rolC y orf13. Estos hallazgos también han servido para elucidar algunas incógnitas acerca del linaje de N. tabacum; siendo esta es una especie anfidiploide, es decir un híbrido natural, originado a partir de dos ancestros muy cercanamente relacionados a las actuales especies N. silvestre y N. tomentosiformis. El análisis de Southern blot llevado a cabo por Meyer et al., en 1995 demostró que el gen trolC deriva del ancestro N. tomentosiformis, sugiriendo ello que el T-DNAc ha sido el resultado de la transferencia de DNA entre A. rizhogenes y un progenitor moderno del tabaco. Trabajos más reciente como el de Suzuki et al., (2002) y el de Intrieri y Buiatti (2001) confirmaron la presencia de homólogos a los genes mis y orf14 en otras especies del género Nicotiana (mediante análisis de DNA gel blot y PCR), demostrando de esta manera que el T-DNAc no está limitado a la especie N. glauca. 20 La existencia de secuencias similares al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium no ha sido restringida al género Nicotiana, la presencia de estas secuencias también han sido reportada en otros genomas de plantas. Análisis de Southern blot indican que Daucus carota “zanahoria” contiene secuencias homólogas al T-DNA de pRi1855 (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis al T- DNA de pRi8196 (Tepfer, 1984). Sin embargo, los datos obtenidos no son concluyentes y se hace necesario desarrollar más experimentos que permitan confirmar estos resultados. 21 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales 3.1.1 Material biológico:  Plantas de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) cultivar Huachano, con código CIP N° 420065, obtenidas de la Colección Libre de P atógenos del Banco de Germoplasma del Centro Internacional de la Papa (CIP).  Plantas de 86 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) (adicionales a Huachano) pertenecientes a diferentes partes del mundo obtenidas de la Colección Libre de Patógenos del Banco de Germoplasma del CIP (Anexo N°1).  Plantas de 5 entradas de Ipomoea batatas (L.) Lam (4x) obtenidas de la Colección Libre de Patógenos del Banco de Germoplasma del CIP (Anexo N°2).  Plantas de Ipomoea trífida (2x) obtenidas de la Colección Libre de Patógenos del Banco de Germoplasma del CIP, código CIP N° 430406.  Plantas de Ipomoea tabascana (4x) obtenidas de la Colección Libre de Patógenos del Banco de Germoplasma del CIP, código CIP N° 460824.  Plantas de Solanum tuberosum cultivar Desireé, obtenidas de la Colección Libre de Patógenos del Banco de Germoplasma del CIP, con código CIP Nº 800048. 3.1.2 Herramientas bioinformáticas:  Secuencias nucleotídicas parciales homólogas a la región del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, obtenidas de plantas de camote por secuenciación de alto rendimiento de pequeños RNAs de interferencia (small interference RNA) “siRNAs” mediante la tecnología Solexa/Illumina (Kreuze et al., 2009). 22  Secuencias nucleotídicas depositadas en la base de datos GenBank correspondiente a genes del T-DNA del plásmido Ti de cepas de Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, del T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhogenes y de genes homólogos a iaaH e iaaM en Pseudomonas syringae (Anexo N°3). 3.1.3 Software de análisis de datos:  VectorNTI 11.0 (Invitrogen, USA)  MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software Version 5.0, Center for Evolutionary Functional Genomics, The Biodesign Institute, Arizona State University, USA).  DNAstar (DNASTAR, Inc. USA) 3.2 MÉTODOS 3.2.1 Amplificación y clonación de los genes Acs, C, iaaH, iaaM y sus respectivas regiones intergénicas mediante PCR. 3.2.1.1 Extracción de DNA genómico. Se realizó el protocolo de extracción de DNA genómico a pequeña escala a partir de hojas de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) y (4x), Ipomoea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x) y de Solanum tuberosum cv. Desiré “papa” (control negativo). Se utilizó el método de Bromuro de cetil-trimetilamonio “CTAB” (Anexo N°5) con algunas modificaciones descritas a continu ación (Manual de Protocolos CIP, 2006): se trituró 200mg de tejido vegetal procedente de hojas en un tubo eppendorf conteniendo la mezcla de 700µL de CTAB más 2µL de β- mercaptoetanol. El tejido triturado fue homogenizado en vortex durante 2 minutos e incubado a 65°C durante 30 minutos. Luego se enfr ió a temperatura ambiente durante 5 minutos y se le agregó 900µL de la mezcla cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se homogenizó y centrifugó en frio (4°C) a 14000 rpm durante 10 minutos. Se transfirió la fase acuosa a otro tubo agregándosele 240µL de isopropanol y se incubó a -20°C durante 20 minutos. Nuevamente se centrifugó en frío (4°C) a 14000 rpm durante 20 minutos, se desca rtó el sobrenadante y el precipitado fue secado a temperatura ambiente. El pellet seco fue lavado con 23 etanol de 70 y 100% para posteriormente ser resuspendido en 150µL de agua libre de nucleasas (NFW). Para la purificación del DNA genómico se agregó 150µL de la mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó en frío (4°C) a 14000rpm durante 5 minutos. Se transfirió el sobrenadante y se agregó 15µL de acetato de sodio 3M pH 5.0, se homogenizó e incubo durante 1 hora a -20°C. Se centrifugó, descartó el sobrenadante y dejó secar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente el pellet se resuspendió en 100µL de NFW e incubó con 5µL de RNAsa (10 mg/ml) a 37°C durante 1 hora. Las mues tras obtenidas fueron conservadas a -20°C. La cuantificación de la concentración del DNA genómico, se realizó mediante observaciones de la corrida electroforética en un gel de agarosa al 1% con buffer TBE 1X (Anexo N° 6), utilizándose 1µL de DNA y 9µL de buffer de carga SALB 1X (Anexo N°6) y comparándose con el mar cador de peso molecular λ/PstI. Además, los datos obtenidos fueron corroborados con mediciones en el espectrofotómetro (Nanodrop). La concentración final se estimó en ng/µL. 3.2.1.2 Diseño y optimización de iniciadores Se diseñaron iniciadores específicos para los 4 genes (Triptófano 2- Monooxigenasa iaaM, indol-3-Acetoamida Hidrolasa iaaH, Agrocinopina Sintasa Acs y gen C) y sus respectivas regiones intergénicas a partir del alineamiento de secuencias de siRNAs de camote previamente obtenidas (Kreuze et al., 2009) con las secuencias disponibles en el Genbank: Agrobacterium tumefaciens str. C58 plasmid Ti y Agrobacterium tumefaciens plasmid pTi Sakura DNA. Los iniciadores fueron diseñados con la ayuda del software Vector NTI 11.0 (Invitrogen, USA). 3.2.1.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Antes de llevar a cabo la amplificación de los fragmentos de interés se realizó un PCR control para verificar la calidad del DNA extraído en las reacciones de PCR. Para ello se emplearon los iniciadores MDH-H968 y MDH-1163 (Li et al., 2004) que amplifican el gen de la Malato Deshidrogenasa (MDH) específico para especies del género Ipomoea. 24 La amplificación de los 4 fragmentos correspondientes a los genes iaaM, iaaH, Acs y C y sus respectivas regiones intergénicas fueron llevadas a cabo utilizando el kit GoTaq™ DNA Polymerase (Promega). Cada mezcla de reacción contenía 5µL de Buffer PCR 5X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9.0), 2.5µL de MgCl2 (25mM), 0.5µL de cada desoxinucleótido trifosfato dGTP, dATP, dTTP, y dCTP (10mM), 0.5µL de cada iniciador sentido y antisentido (10uM), 0.2µL de GoTaq DNA polimerasa (2.5U/µL), 1µL de DNA genómico (100ng/µL) y completado a 25µL de reacción con NFW. Las condiciones de reacción variaron según el tamaño de fragmento, la temperatura de fusión (melting temperature) “Tm” de los distintos iniciadores (X) y tiempos de extensión (Y); resumiéndose de la siguiente manera: 95oC por 2 min, seguida de 35 ciclos de 95oC por 30s, X°C por 30s y 72oC por Ys, y luego una elongación final a 72oC por 10 min. Los productos de PCR fueron separados en geles de agarosa al 1% y los fragmentos de interés recuperados utilizando el kit Wizard SV de Extracción de gel (Promega) según las especificaciones de la compañía. 3.2.1.4 Ligación y clonación de fragmentos de PCR: El DNA recuperado fue ligado en un vector plasmídico pGem-T Easy (Promega) siguiendo las especificaciones de la compañía: se mezcló 5µL de Buffer 2X de Ligación (60mM Tris-HCl, pH 7.8, 20mM MgCl2, 20mM DTT, 2mM ATP, 10% polietilen glicol), 1µL del vector pGem-T Easy (50ng/µL), 1µL de la enzima T4 DNA ligasa (3 unidades Weiss/µL) y 3µL de producto de PCR (100ng/µL), e incubó a 4°C durante toda la noche. E l plásmido cuenta con dos sitios de corte restricción con la enzima EcoRI para la comprobación de la inserción del fragmento deseado (Figura 5). 25 Figura 5.- Esquema de los eventos de ligación de los fragmentos obtenidos mediante PCR en el plásmido pGem-T Easy (Promega) . El fragmento ligado fue luego introducido en la E. coli DH5α mediante transformación por golpe de calor según los siguientes pasos: se mezcló el producto de la ligación y 100µL de cultivo bacteriano durante 30 min a 4ºC. Luego se incubó la mezcla durante 1 minuto a 42oC y rápidamente se volvió a incubar a 4oC durante 5 minutos. Se agregó medio SOC (Sigma-Aldrich) enriquecido con glucosa y dejó incubando a 37oC durante una hora. En este lapso de tiempo, se preparó placas de cultivo con Ampicilina 100ppm, conteniendo 25µL de IPTG 100mM y X-Gal 100mM cada una. Se sembró el cultivo líquido por diseminación e incubó a 37oC toda la noche. Al día siguiente, se seleccionó las colonias blancas conteniendo el inserto y cultivó en medio LB líquido conteniendo 100 ppm Ampicilina a 37oC todo la noche. La extracción de plásmidos conteniendo el fragmento de interés se realizó utilizando el Kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systems (Promega). 3.2.1.5 Análisis de restricción El DNA plasmídico obtenido en el paso anterior fue sometido a un análisis de restricción con el fin de comprobar la presencia de los fragmentos clonados en el vector. Para ello se digirió 1µL de DNA plasmídico con la enzima de restricción EcoRI (Biolabs New England) durante dos horas a 37°C. Las muestras digeridas fueron luego sometidas a una corrida electroforética en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos obtenidos fueron visualizados mediante el uso del transiluminador UV. 26 3.2.1.6 Secuenciación y ensamblaje de los fragmentos obtenidos La secuenciación de los plásmidos conteniendo el fragmento deseado fue realizada con los iniciadores estándar M13 (sentido y antisentido) y fue llevada a cabo por la compañía Macrogen (Korea). Se enviaron a secuenciar al menos tres clones individuales por cada gen y región intergénica, si eran detectados conflictos se secuenciaban nuevos clones. En caso de gaps inesperados, el fragmento fue reamplificado y re-secuenciado. Las secuencias sentido y antisentido fueron obtenidas en los formatos: abi, txt, phd.1 y pdf, y ensambladas en secuencias consenso tomando como molde la secuencia completa del genoma de Agrobacterium tumefaciens str.58 plasmid Ti y con la ayuda del programa Seqman, que está incluido en el paquete bioinformático DNASTAR (DNASTAR Inc., USA). Posteriormente, las secuencias consensos fueron alineadas con otras secuencias nucleotídicas homólogas de la base de datos del GenBank mediante el uso del programa BlastN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). 3.2.2 Amplificación y clonación de secuencias nucleotídicas “no conocidas” mediante PCR-Genome Walker. Debido a que las secuencias nucleotídicas previamente obtenidas para los 4 genes: iaaM, iaaH, Acs, C y sus respectivas regiones intergénicas no formaron un solo contig se diseñó una estrategia que nos permitiera ensamblarlas juntas y además obtener información acerca de las secuencias adyacentes a éstas. Con este fin se desarrolló el PCR-Genome Walker (Clontech, 2007), una técnica molecular que permite identificar secuencias de DNA genómico no conocidas adyacentes a secuencias conocidas. El protocolo desarrollado se basó en el empleado por Sierbert et al., (1995) con algunas modificaciones descritas a continuación: se construyeron “bibliotecas” de fragmentos de DNA genómico (no clonados) ligados a un adaptador “Genome Walker adaptor”, conocidos como “Bibliotecas Genome Walker”, a través de un paso previo de digestión con enzimas de restricción. Posteriormente, se llevaron a cabo dos amplificaciones por PCR-Touchdown para cada librería. En el PCR primario se empleó un iniciador correspondiente a la región externa del adaptador denominado AP1 y otro iniciador externo específico a la región adyacente conocida. En el PCR 27 secundario o PCR-Nested, se empleó un iniciador correspondiente a la región interna del adaptador denominado AP2 y otro iniciador interno específico a la región adyacente conocida. El protocolo esquematicamente se muestran en la Figura 6. 3.2.2.1 Diseño de iniciadores Para el diseño de los iniciadores específicos (externos e internos) de las regiones adyacentes conocidas se empleó el software Vector NTI 11, estas regiones adyacentes incluían las secuencias correspondientes a los extremos iaaM, Acs y C. Las secuencias de los iniciadores correspondientes al adaptador y el mismo adaptador fueron reportadas previamente y adquiridas a partir del kit PCR-Genome Walker (Clontech, USA) (Tabla N°1). Se evaluaron in silico la formación de dímeros, heterodímeros y estructuras secundarias entre los iniciadores específicos y los iniciadores del adaptador mediante el programa Vector NTI 11.0. Tabla 1.- Iniciadores del Adaptador Melting Iniciador Secuencia nucleotídica Temperature “Tm” (ºC) ADP1 GTAATACGACTCACTATAGGGC 59.0 ADP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT 71.0 3.2.2.2 Construcción de Bibliotecas Genome Walker Para la construcción de las cuatro Bibliotecas Genome Walker se digirió DNA genómico de Ipomoea batatas (L.) Lam cv. Huachano (100ng/µL) con las enzimas de restricción: DraI, EcorV, PvuII y StuI (New England Biolabs), cuyas características se encuentran descritas en la Tabla 2. Luego de revisar la calidad de las digestiones las muestras fueron purificadas con acetato de potasio (C2H3O2K) 3M pH 5 y etanol 95%. Seguidamente los fragmentos de DNA 28 digeridos con cada enzima fueron ligados a un adaptador “Genome Walker adaptor” (Clontech, 2007) siguiendo las especificaciones de la compañía: se mezcló 4µL de producto digerido, 1.9µL de adaptador (25uM), 1.6µL de buffer de ligación 10X (300mM Tris-HCl, pH 7.8 a 25°C, 100mM MgCl2, 100mM DTT y 10mM ATP), 1µL de la enzima T4 DNA ligasa (6 unidades Weiss/µL) e incubó a 16°C durante toda la noche. Al día siguiente se det uvo la reacción a 70°C por 5 minutos y se completó a un volumen final de 100µL con buffer TE (10/1, pH 7.5). 29 Figura 6.- PCR-Genome Walker . El DNA genómico es digerido con enzimas de restricción de corte poco frecuente, y los fragmentos resultantes son ligados a un adaptador de secuencia conocida generándose las denominadas Bibliotecas Genome Walker. Estas son posteriormente amplificadas por PCR- Nested usando iniciadores específicos y caracterizadas mediante clonamiento y secuenciamiento. 30 Tabla 2.- Características de las enzimas de restricción usadas para la construcción de Bibliotecas Genome Walker Enzima Motivo Temperatura Extremos generados Dra I TTT/AAA 37°C Romos EcorV GAT/ATC 37°C Romos Pvu II CAG/CTG 37°C Romos Stu I AGG/CCT 37°C Romos 3.2.2.3 PCR-Touchdown El PCR-Touchdown es una variante de la técnica de PCR que se emplea cuando se quiere incrementar la especificidad de la reacción, ello implica el uso de una temperatura de hibridación/extensión que es varios grados más alta que el Tm de los iniciadores durante los ciclos iniciales. Aunque la hibridación de los iniciadores (y amplificación) es menos eficiente a estas altas temperaturas, esto resulta más específico. La temperatura de hibridación/extensión es luego reducida ligeramente por debajo del Tm de los iniciadores para los ciclos restantes, permitiendo la amplificación eficiente y exponencial de los productos gen- específicos. En el caso del protocolo empleado se lleva a cabo un PCR secundario o PCR- Nested adicional con el fin de incrementar la sensibilidad de la técnica. 3.2.2.3.1 PCR primario El PCR primario se llevó a cabo utilizando el kit PfuUltra™ II Fusion HS DNA Polymerase con algunas modificaciones descritas a continuación: Se mezcló 5µL de buffer 10× PfuUltra™ II Reaction, 0.5µL de cada desoxinucleótido trifosfato dGTP, dATP, dTTP, y dCTP (25mM), 1µL de cada iniciador sentido y antisentido (10uM), 0.5µL de PfuUltra™ II Fusion HS DNA Polimerasa, 1µL del producto de la ligación y se completó con NFW el volumen final de la reacción a 50µL. Las condiciones del programa variaron según la gradiente de Tm de los distintos 31 iniciadores (X) y se resumieron de la siguiente manera: 94°C por 2 min, seguida de 7 ciclos de 94oC por 25s y X°C por 3min, 32 ciclos de 94 oC por 25s y X°C por 3min y 1 ciclo final de X°C por 7 min. Los producto s de PCR de la gradiente de Tm fueron separados mediante una corrida electroforética en geles de agarosa al 1%. 3.2.2.3.2 PCR secundario ( Nested ) Las mezclas de reacción fueron preparadas bajo las mismas condiciones que en el PCR primario, excepto por los iniciadores sentido y antisentido. Además, se utilizó como muestra la dilución 1/50 del producto amplificado en el PCR primario. Al igual que en el paso anterior las condiciones del programa variaron según la gradiente de Tm de los distintos iniciadores (X), las cuales se resumieron de la siguiente manera: 94°C por 1 min, seguida de 5 ciclos de 94oC por 25s y X°C por 3min, 25 ciclos de 94 oC por 25s y X°C por 3min y 1 ciclo final de X°C por 7 min. Los productos de PCR de la gradie nte de Tm fueron separados en geles de agarosa al 1% y los fragmentos de interés recuperados utilizando el kit Wizard SV de Extracción de gel (Promega) según las especificaciones de la compañía. 3.2.2.4 Ligación, clonación y secuenciación de los fragmentos de interés Los fragmentos de DNA recuperados fueron ligados al vector plasmídico pGem-T Easy (Promega), luego estos plásmidos fueron introducidos en la bacteria E. coli DH5α mediante transformación por golpe de calor, luego cultivados en medio de cultivo SOC, extraídos con el kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systems (Promega) y digeridos con la enzima de restricción EcoRI (Biolabs New England) para confirmar la presencia de los fragmentos de interés. Finalmente, los clones seleccionados fueron enviados a secuenciar a Macrogen (Korea). 3.2.3 Análisis filogenético 3.2.3.1 Secuencia completa La organización genómica de los genes del T-DNA hallados fue construida con el programa Vector NTI 11.0 y comparada con la de cepas de A. tumefaciens y A. vitis, manualmente. 32 3.2.3.2 Genes individuales La búsqueda de genes homólogos a Acs, C, iaaH e iaaM se realizó con la opción tBLASTx del servidor http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Solo se consideraron hits de secuencias de Agrobacterium que tengan un query coverage mínimo de 55% y un e-value de al menos e-50. El alineamiento de las secuencias obtenidas se realizó con el programa clustal W del paquete bioinformático MEGA 5, las secuencias fueron editadas y revisadas manualmente. Las relaciones filogenéticas entre las secuencias obtenidas de los genes del T-DNA de camote y de otras cepas del género Agrobacterium fueron establecidas mediante la reconstrucción de árboles filogenéticos utilizando los modelos de substitución nucleotídica que mejor se adecuaron para cada alineamiento. Para determinar la elección de dichos modelos se utilizó la opción Model selection (ML) del programa MEGA 5 la cual presenta 24 modelos tentativos los que se valoraron utilizando el criterio bayessiano (BIC). El método de reconstrucción utilizado fue el de Neighbor-Joining. Tanto el método de reconstrucción filogenética como los modelos de substitución nucleotídica elegidos se encontraron disponibles en el programa MEGA 5. La confiabilidad de los árboles fue evaluada mediante pruebas de boostrap (valor estadístico que estima el nivel de confianza de una relación filogenética inferida) de 1000 repeticiones en todos los casos. 3.2.4 Hibridación por Southern Blot La hibridación es una técnica que consiste en la asociación de una hebra de ácidos nucleicos con otra hebra complementaria marcada (sonda) a fin de visualizar la formación de moléculas de doble hebra de DNA. Esta técnica resulta muy específica debido a la complementariedad de las hebras de los ácidos nucleicos, por esto es una de las más empleadas en biología molecular. La hibridación por Southern Blot fue desarrollada por Edwin Southern en 1975 y consiste en la transferencia de los fragmentos de DNA de un gel de agarosa previamente separados por electroforesis a una membrana. En la transferencia, los ácidos nucleicos desnaturalizados son inmovilizados sobre un 33 soporte inerte o matriz (membrana) de tal manera que se evita la rehibridación de las secuencias dentro de la muestra, no perdiendo su capacidad de hibridación. La inmovilización del ácido nucleico generalmente es seguida de un proceso de fijación (luz ultravioleta) empleado para aumentar la sensibilidad del sistema. Debido a que se pueden emplear diversos tipos de membranas para la inmovilización y fijación de los ácidos nucleicos, las matrices más adecuadas para la mayoría de aplicaciones son los filtros de nylon y nitrocelulosa. Una vez transferido y desnaturalizado el DNA, se realiza la hibridación empleando una sonda determinada con la finalidad de verificar la presencia del gen de interés dentro del genoma de la planta, y también poder determinar el número de copias. En el presente trabajo, la detección y marcaje de la sonda se basó en un sistema de quimioluminiscencia, en donde el DNA fue marcado con Digoxigenina (DIG) y detectado a través de la señal quimioluminiscente generada por la reacción de la fosfatasa alcalina y su correspondiente sustrato (CSPD). Este es un método no radioactivo que ofrece mayor seguridad, fácil manejo y menor peligro de contaminación. La hibridación por Southern blot constó de los siguientes pasos: 3.2.3.1 Extracción de DNA genómico. Se realizó el protocolo de extracción de DNA genómico a mediana escala (Manual de Protocolos CIP, 2006) a partir de hojas de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) y (4x), Ipomoea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x) y de Solanum tuberosum cv. Desiré “papa” (control negativo), con algunas modificaciones descritas a continuación: se trituró 4g de tejido vegetal procedente de hojas con nitrógeno líquido y se transfirió a tubos Falcon de 50ml conteniendo la mezcla de 20ml de CTAB más 200µL de β-mercaptoetanol. El tejido triturado fue homogenizado en vortex durante 2 minutos e incubado a 65°C durante 30 minutos. Luego se enfrió a temperatura ambiente durante 5 minutos y se le agregó 20ml de la mezcla cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se homogenizó y centrifugó en frió (4°C) a 6000 rpm durante 15 minu tos (2 veces). Se transfirió la fase acuosa a otro tubo agregándosele 15ml de isopropanol frio y se incubó a - 34 20°C durante 1 hora. Se centrifugó y se transfirió el DNA a tubos Eppendorf de 2ml. Seguidamente se lavó el pellet con las soluciones de lavado I, II (Anexo N°5) y etanol al 75%; se centrifugó y secó a temperatura ambiente. El pellet seco fue resuspendido en 500µL de agua libre de nucleasas (NFW). Para la purificación y cuantificación del DNA se siguió el protocolo descrito anteriormente. 3.2.3.2 Análisis de restricción y digestión del DNA genómico Se analizó los sitios de restricción presentes en el fragmento completo obtenido mediante el uso del programa Vector NTI 11.0 (Invitrogen, USA). El criterio de selección de la enzima se basó en la frecuencia del sitio de corte en el genoma de la planta y en el fragmento a analizar. Debido a la ausencia de la secuencia completa del genoma de camote, éste se llevó a cabo en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Después del análisis de restricción, se digirió 30µg de DNA de cada muestra con 100 U de la enzima de restricción elegida, en un volumen final de reacción de 600µL. Se incubó las muestras a 37ºC durante 24 horas y posteriormente se verificó la digestión completa mediante una corrida electroforética de 5µL de cada muestra en un gel de agarosa al 1% con TBE 1X. Una vez verificada la digestión se procedió a concentrar las muestras en el liofilizador (SC110A Speed vac, SAVANT) con la finalidad de reducir el volumen de reacción a aproximadamente 80µL (volumen máximo de muestra/pozo de gel). Seguidamente se agregó buffer de carga 1X a cada muestra y se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%. Adicionalmente se colocó el marcador de peso molecular λ/PstI así como también 50-80 pg de producto de PCR (sonda no marcada) como un control positivo. Las muestras fueron corridas a 30 voltios durante toda la noche. Finalizada la corrida electroforética se verificó la separación de las bandas observando el gel bajo un transiluminador de luz UV. 3.2.3.3 Transferencia Southern Después de verificar la correcta separación de las bandas, se lavó el gel con agua destilada para eliminar los residuos de bromuro y se le sometió a un proceso de despurinación por 10 minutos en una solución de 250 ml HCl 0.25M (Anexo N°7) con 20 rpm de agitación (New Brunswick, SCIENTIFIC USA) a 35 temperatura ambiente. Luego se hicieron dos lavados con solución desnaturalizante (Anexo N°7) por 15 minutos con agi tación suave. Seguidamente se trató el gel con solución neutralizante (Anexo N°7) a pH 8.0, el mismo tiempo y número de veces que en el paso anterior. A continuación, los fragmentos de DNA fueron transferidos a una membrana de nylon Hybond N+ (RPN 303B, AMERSHAM), siguiendo el método de transferencia por capilaridad descrito por Southern (1975) (Figura 7). El sistema de transferencia se armó de la siguiente manera: en una bandeja de vidrio que contenía SSC20X (Anexo N°7) s e colocó un soporte de acrílico o vidrio y sobre él una tira de papel blotting (Hybond-N+ RPN6103M, AMERSHAM) embebido en solución SSC20X (a manera de puente). Los bordes de dicho papel fueron sumergidos en la solución de transferencia. Sobre el papel blotting se colocó el papel Whatman 3 MM (P-7176, SIGMA) cortado del mismo tamaño del gel y embebido en la solución de transferencia (evitando siempre que se formen burbujas). Alrededor del gel se colocó tiras de Parafilm ® para prevenir que el tampón de transferencia sea absorbido directamente por el papel toalla. Sobre el gel se colocó la membrana Hybond N+ con el papel Whatman 3MM cortado con las dimensiones del gel y encima un paquete de papel toalla (de medidas aproximadas 13 x 23 y 5cm de alto), sobre esto se colocó un peso para que exista un mejor contacto del gel con la membrana (Figura 7). La transferencia se dejó por 18 a 20 horas. Después, se desarmó con cuidado todo el sistema y se dejó secar la membrana a temperatura ambiente sobre papel filtro por aproximadamente 2 horas. Transcurrido este tiempo se fijó el DNA a la membrana exponiéndola a luz ultravioleta a 120,000 microJoules por un tiempo aproximado de 15 segundos (Stratalinker UV Crosslinker 2400, STRATAGENE). Seguidamente la membrana fue guardada a temperatura ambiente hasta el momento de la hibridación. 36 Figura 7.- Sistema de transferencia Southern (Manual CIP, 2006). 3.2.3.4 Preparación y marcaje de la sonda Se seleccionó como sonda parte de la secuencia nucleotídica correspondiente al gen C. Para la obtención de ésta se empleó DNA genómico de camote cv Huachano. El marcaje de la sonda se realizó con DIG empleando el kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche). La sonda fue sintetizada usando los iniciadores Ib-Cprot3F e Ib-Cprot4R (Tabla 3) y el tamaño esperado fue de 775pb. Tabla 3.- Iniciadores utilizados para la síntesis y marcaje de la sonda Iniciador Secuencia Tm ( ºC) Ib-Cprot3-F CTTTGCGACTCATCCAACACGT 56.5 Ib-Cprot4-R AATCCACTCTGTCCTTCTCGGA 54.3 La preparación de la mezcla de reacción de PCR se siguió según las recomendaciones del fabricante, con algunas modificaciones descritas a continuación: La mezcla de reacción contenía 2.5µL de Buffer PCR 10X (con MgCl2, 15mM), 2.5µL de PCR DIG probe synthesis (10X), 2.5µL de cada iniciador 37 sentido y antisentido (10uM), 0.5µL de Enzyme mix for PCR labeling (3.5U/µL), 1µl de DNA genómico (100ng/µL) y completado a un volumen final de 25µL con NFW. Para esta reacción se preparó un control no marcado utilizando sólo dNTPs (10X) en lugar de PCR DIG probe synthesis (10X). Las condiciones de PCR se resumieron de la siguiente manera: 95°C por 2 min, seguida de 40 ciclos de 95oC por 30s, X Temperatura alineamiento (°C) por 30s y 72oC por Y (Tiempo de extensión) s, y luego una elongación final a 72oC por 10 minutos. Para confirmar el marcaje de la sonda, se hizo una corrida electroforética de 1µL del producto amplificado y 1µL del control no marcado en un gel de agarosa al 1%. 3.2.3.5 Pre-hibridación e Hibridación Antes de empezar ambos procesos es necesario conocer la temperatura de hibridación de la sonda con la que se va a trabajar, la cual va a depender de su contenido de Guanina y Citosina (GC). El cálculo se realizó siguiendo la siguiente ecuación: Tm = 49.82 + 0.41 (% G + C) - (600/l) [l = longitud de la sonda en pares de bases] T óptima = Tm - (20 a 25°C) Para el proceso de pre-hibridación, se colocó la membrana en un tubo de hibridación (26 cm x 3.5 cm, AMERSHAM) con aproximadamente 15ml de la solución de pre- hibridación (DIG Easy Hyb, ROCHE) y se dejó incubar por una hora a 65°C. Este paso se realizó con el fin de evi tar que la sonda hibride en lugares inespecíficos de la membrana, de tal manera que sólo la secuencia del DNA a ser hibridado quede libre para ser reconocido por la sonda. Antes de seguir con el paso de hibridación es necesario desnaturalizar la sonda, para ello se adicionó 375ng de la sonda marcada con DIG (obtenida por PCR) en 1mL de la solución de pre-hibridación y se desnaturalizó durante 5 minutos a 95ºC, seguidamente la muestra fue colocada en hielo por otros 5 minutos. 38 El siguiente paso fue agregar la sonda (marcada y desnaturalizada) al tubo conteniendo la membrana e incubarla a 65°C durante toda la noche. Esta etapa fue la más importante del proceso ya que fue aquí donde los fragmentos de DNA desnaturalizados de la sonda hibridaron específicamente con la secuencia complementaria de DNA inmovilizada en la membrana. 3.2.3.6 Lavados de estringencia Seguidamente, se descartó la solución de hibridación e inmediatamente se agregó la primera solución de lavado I (Anexo N°8); se lavó dos veces durante 10 minutos a temperatura ambiente y en agitación. Transcurrido el tiempo indicado se retiró la primera solución y se agregó la segunda solución de lavado II (Anexo N°8) previamente calentada a 68°C; se lavó dos vece s durante 15 minutos a 68°C y en agitación. Las soluciones empleadas en este paso permitieron remover la sonda que no hibridó con el DNA, mientras que las secuencias de DNA totalmente complementarias permanecieron unidas o hibridadas. 3.2.3.7 Detección y autoradiografías La detección de la sonda se llevo a cabo usando el kit CSPD Disodium 3- (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}-4-yl) phenyl phosphate (Roche). Para este paso se siguió las especificaciones del fabricante, con algunas modificaciones descritas a continuación: Terminados los lavados, se colocó la membrana en una bandeja limpia y se le agregó el buffer de lavado (Anexo N°8) durante 1 -5 minutos, con el fin de remover los restos de las soluciones anteriores. Seguidamente se agregó la solución de bloqueo 1X (Anexo N°8) durante 30 minut os, a temperatura ambiente y en agitación constante. Ello con el objetivo de bloquear la membrana y así evitar que el anticuerpo conjugado (siguiente paso) reaccione en lugares inespecíficos, de tal manera que sólo la secuencia del DNA hibridada quede libre para su reconocimiento. Luego, se agregó la solución del anticuerpo conjugado anti-DIG (dilución 1:10,000 en solución de bloqueo 1X) y se incubó durante 30 minutos (tiempo exacto), a temperatura ambiente y en agitación constante; en este paso se da la reacción antígeno - anticuerpo conjugado que posteriormente se 39 evidenciará cuando la fosfatasa alcalina (parte del conjugado) actúe sobre el sustrato. Posteriormente, se lavó la membrana nuevamente con el buffer de lavado (dos veces durante 15 minutos y en agitación constante) y se agregó la solución de detección (Anexo N°8) incubándola durante 5 minu tos y a temperatura ambiente, con el fin de equilibrarla antes de agregar el sustrato. Seguidamente, se colocó la membrana en una bolsa plástica (con el lado de las muestras de DNA hacia arriba) y se aplicó 4ml de la solución de trabajo CSPD (sustrato) de una dilución 1:150 (en solución de detección) cubriéndola y evitando que se formen burbujas, se dejó incubando a temperatura ambiente por 5 minutos. Finalmente, la membrana se fijó en un cassette de exposición (Hipercassette, AMERSHAM) y fue expuesta a una película de rayos x (RPN1678 Hyperfilm, AMERSHAM). Este último paso se realizó en el cuarto oscuro para evitar velar la película. El cassette se guardó a temperatura ambiente por 24 horas. Transcurrido este tiempo se reveló la película colocándola primero en la solución de revelado Kodak GBX (SIGMA) por 2 minutos, se enjuagó con agua destilada y se lavó con fijador Kodak GBX (SIGMA) por 2 minutos. La película revelada se enjuagó en agua y se dejó secar. 40 IV. RESULTADOS 4.1 Amplificación y clonación de los genes iaaM, iaaH, Acs, C y sus respectivas regiones intergénicas del T-DNA de camote mediante PCR. 4.1.1 Extracción de DNA genómico Las modificaciones hechas al método del CTAB resultaron ser muy efectivas para la extracción de DNA genómico a pequeña escala de hojas de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) (87 cultivares) y (4x) (5 entradas), Ipomoea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x), y de Solanum tuberosum cv. Desireé “papa” (control negativo). La Figura 8, muestra los resultados de calidad de DNA genómico luego de correr 1µL de resuspendido final de la extracción en un gel de agarosa al 1%. La concentración de DNA obtenido varió entre 200- 300 ng/µL. 1 2 3 4 5 6 λ/PstI 14000 pb 800 pb Figura 8.- Calidad del DNA genómico. Carril 1: I. batatas (L.) Lam (6x) cv Huachano, Carril 2: I. batatas (L.) Lam (6x) cv Jewel, Carril 3: I. batatas (L.) Lam (4x), Carril 4: Ipomoea trífida (2x), Carril 5: Ipomoea tabascana (4x) y Carril 6: Solanum tuberosum cv. Desiré papa; λ/PstI: marcador de tamaño molecular. 4.1.2 Diseño de iniciadores Los iniciadores diseñados tuvieron una longitud promedio de 20-25pb y un Tm de aproximadamente 50°C. Se estandarizaron las con diciones de amplificación para cada par de iniciadores y se realizaron PCR con gradientes de temperatura para encontrar la temperatura de hibridación óptima para cada 41 reacción, tal como se muestra en la Figura 9. La Tabla 4 muestra la secuencia nucleotídica y los Tm calculados para cada una de los iniciadores diseñados. Tabla 4.- Lista de iniciadores empleados para la amplificación del T-DNA de camote . Iniciador Secuencia Tm IbCprot2F GATCAGTACGAACGCAAGCAAG 54.2 IbCprot2R CTTGCTTGCGTTCGTACTGATC IbCprot4F TCCGAGAAGGACAGAGTGGATT 54.3 IbCprot4R AATCCACTCTGTCCTTCTCGGA IbCprot5F GTCCATTTCTTCAACGATATACG 50.2 IbCprot5R CGTATATCGTTGAAGAAATGGAC IbAcs1F AGTCAGCGATTGCAGCGGTA 55.8 IbAcs1R TACCGCTGCAATCGCTGACT IbAcs3F TGGGAAACGATAGGGACGC 54.7 IbAcs3R GCGTCCCTATCGTTTCCCA IbiaaH1F CGGCAAACCGTCTGATGTGA 56.7 IbiaaH1R TCACATCAGACGGTTTGCCG IbiaaH3F ATCGGGCTTCTAGGGTTTGGACT 58.2 IbiaaH3R AGTCCAAACCCTAGAAGCCCGAT IbT2M1F ACTCCAGACGATCTTAGCCACTTC 54.8 IbT2M1R GAAGTGGCTAAGATCGTCTGGAGT IbT2M3F CAGGAGGAGTGCTGGAGAATG 53.7 IbT2M3R CATTCTCCAGCACTCCTCCTG 42 4.1.3 Amplificación y clonación de los fragmentos de interés En este estudio se identificaron por PCR las secuencias nucleotídicas correspondientes a los genes: C, Acs, iaaH, iaaM y a las regiones intergénicas C–iaaH e iaaH–T2M. Se obtuvieron resultados positivos en los 87 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam analizados, incluyendo el cv Huachano. Sin embargo, las muestras correspondientes a Ipomoea trífida (2x), Ipomoea batatas (L.) Lam (4x), Ipomoea tabascana (4x) y Solanum tuberosum cv Desireé “papa” (control negativo) dieron resultados negativos en todas las amplificaciones realizadas (Tabla 5). Asimismo, todas las muestras analizadas, excepto papa, dieron resultados positivos para el PCR control con el gen MDH (400pb), confirmando la calidad óptima de las muestras de DNA para las reacciones de PCR y a la vez su especificidad para el género Ipomoea. Las condiciones y tamaños esperados de las reacciones de PCR realizados para todos los genes y las regiones intergénicas se muestran en la Tabla 6. Tabla 5.- Resultados de las amplificaciones por PCR de los genes y regiones intergénicas del T-DNA. I. batatas I. batatas Genes/ Ipomoea Ipomoea Solanum (L.) Lam (L.) Lam regiones trífida tabascana tuberosum (6x) 87 (4x) 5 intergénicas (2x) (4x) “Desireé” cultivares entradas C- protein + - - - - Acs + - - - - iaaH + - - - - iaaM + - - - - C-prot-iaaH + - - - - iaaH- iaaM + - - - - MDH + + + + - 43 Tabla 6.- Condiciones de PCR para la amplificación de las regiones génicas e intergénicas del T-DNA. Gen / Condiciones de PCR Región Iniciadores intergénica utilizados Tamaño Desnaturalización Hibridación Extensión esperado(pb) C IbCprot2F 1350pb 95 x 30” 51 x 30” 72 x 1’21” IbCprot5R Acs IbAcs1F 854pb 95 x 30” 55 x 30” 72 x 53’’ IbAcs3R iaaH IbiaaH1F 1199pb 95 x 30” 55 x 30” 72 x 1’15” IbiaaH3R iaaM IbT2M1F 1777pb 95 x 30” 54 x 30” 72 x 1’48” IbT2M3R C – iaaH IbCprot5F 650pb 95 x 30” 55 x 30” 72 x 40’’ IbiaaH1R iaaH – IbiaaH3F 869pb 95 x 30” 55 x 30” 72 x 53’’ iaaM IbT2M1-R En la Figura 9 se puede apreciar la amplificación por PCR del gen C usando los iniciadores IbCprot2F e IbCprot5R. La gradiente de temperatura generada fue desde 46 a 54°C. Se puede observar que conforme se incrementa la temperatura se disminuye la presencia de bandas inespecíficas obteniéndose a partir de 51°C de temperatura un solo producto amplificado del tamaño esperado (1347pb). 44 λ/PstI 44.1 47.4 48.9 50.3 51 52.3 53.4 54.4 14000 pb 1347 pb 800 pb Figura 9.- Gradiente de PCR para la amplificación del gen C. Cada carril corresponde a una temperatura de la gradiente; λ/PstI, marcador de tamaño molecular. La clonación de los productos amplificados solo se llevó a cabo en el cultivar Huachano. Se escogió este cultivar debido a que en él fueron encontradas las secuencias de siRNAs a partir de las cuales se diseñaron los iniciadores para las reacciones de PCR. La Figura 10 muestra un análisis de restricción realizado a vectores plasmídicos pGem-T Easy (Promega) conteniendo el gen C, éstos fueron digeridos con la enzima EcoRI para comprobar la inserción del gen. Como se puede observar, los plásmidos 1, 3 y 4 contienen el gen de interés ya que presentan los 2 fragmentos esperados (uno de aprox. 3Kb correspondiente al plásmido solo y otro de 1347pb correspondiente al tamaño del gen C), únicamente el plásmido 2 no contiene el gen de interés. 45 λ/PstI P1 P2 P3 P4 14000 pb 3.0 Kb 1700 pb 1347 pb Figura 10.- Análisis de restricción con EcoRI. Los carriles P1, P2 P3 y P4, corresponden a los plásmidos 1, 2, 3 y 4; λ/PstI, marcador de tamaño molecular. 4.1.4 Análisis de las secuencias obtenidas Las secuencias ensambladas se agruparon en 2 contigs, el primero comprendía a un tamaño de 792pb y estaba constituido por secuencias parciales del gen Acs mientras que el segundo poseía un tamaño de 4837pb y abarcaba las secuencias completas de los genes C, iaaH, iaaM y las regiones intergénicas C– iaaH e iaaH–iaaM. La Figura 11 muestra una vista estratégica del ensamblaje de este último contig obtenido con el programa Seqman, y en donde no se observan gaps ni regiones conflicto a lo largo de la secuencia. Figura 11.- Ensamblaje de secuencias correspondientes al T-DNA encontradas en el genoma de camote. IbCprot: iniciadores del gen C, IbiAAH: iniciadores del gen iaaH, IbT2M: iniciadores del gen iaaM. 46 Los resultados obtenidos hasta esta etapa permitieron identificar la longitud de los genes: C, iaaH e iaaM, las cuales correspondieron a 1620pb, 1413pb y 2200pb; y además, la presencia de un “indel” (inserción/delección) en la región correspondiente al gen iaaM, de 901pb (Figura 12), la cual fue identifcada al compararla con secuencias homólogas a este gen de cepas de Agrobacterium spp. depositadas en la base de datos GenBank. Figura 12.- Mapa génico del T-DNA de camote resultante de los análisis de PCR. 4.2 Amplificación y clonación de secuencias nucleotídicas “no conocidas” mediante PCR- Genome Walker. 4.2.1 Diseño de iniciadores Los resultados obtenidos previamente proporcionaron la información necesaria para diseñar los iniciadores PCR- Genome Walker. Estos iniciadores se caracterizaron por poseer una longitud promedio de 26 a 30 nucleótidos, entre 40 y 60% de contenido de GC y poseer una Tm entre 60 y 70°C. La lista completa de los iniciadores se muestra en la Tabla 7. 47 4.2.2 Construcción de “Bibliotecas Genome Walker” Se construyeron exitosamente 4 “Bibliotecas Genome Walker” correspondientes a las 4 enzimas de restricción empleadas: DraI, EcorV, PvuII y StuI. En la Figura 13 se puede verificar la digestión completa realizada con cada enzima de restricción previamente a la ligación con el adaptador. Tabla 7.- Iniciadores diseñados para el desarrollo de la técnica de Genome walker Iniciador Secuencia Tm AGRO R1 4213 CTGGAAGGCTACAATTTGCGTAATTTGGCA 66.7 AGRO R2 3951 TACGCTGGGTTGGCAAGATACAAGACGACA 68.2 AGRO R3 3856 CCTGATCTGTCTCTCGACATTTCCAATCGAC 64.3 AGRO F1 18110 CATCCAAGCTGTTCTTGCTGACCGAGAGGA 69.2 AGRO F2 18090 AACACACACATGACGGGATCATCCAAGCTG 68.7 AGRO F3 18411 TCAACATGATTGGCTAACGGACAAGCATG 64.1 AGRO 18732 F2' AGGAGTGCTGGAGAATGGCAATCCAATCG 68.9 AGRO 18715 F1' GTAATCCATCATTCAGGAGGAGTGCTGGAG 64.7 AGRO 3221 R2' CGAAGCGTCGGAGATTTATTCTTGCGATAC 66 AGRO 3623 R1' ATCCGCTTCTTGCTTGCGTTCGTACTGATC 68.1 AGRO T2M 7285 F GCGGAGGCTCTGTGTGATTTAGTCTCACGA 67.6 AGRO T2M 7147 F ATCATTCAGGAGGAGTGCTGGAGAATGGC 66.8 AGRO T2M 7090 F AGGCTGGGTCGAGGGAGCAATTCAAAC 67.5 AGRO Acs 121 R TCGTCCATTGAAGAGATCCGCCAAGAGTT 67.1 AGRO Acs 245 R TTCAAGAAACGGAATGCAATCAGGTGTACG 64.1 AGRO Acs 316 R GCCTCATAGTTCCTTCCATCCAGAAAGACG 65.5 48 L1 L2 L3 L4 λ/PstI 14000 pb 1700 pb Figura 13.- Digestión enzimática de las Bibliotecas Genome Walker . L1, L2, L3 y L4, librerías DraI, EcorV, PvuII y StuI, respectivamente; λ/PstI, marcador de tamaño molecular. 4.2.3 PCR Touchdown Se realizaron 6 reacciones de PCR touchdown con los iniciadores previamente descritos. Estos resultados nos permitieron obtener 10 secuencias nucleotídicas correspondientes a las 4 bibliotecas DraI, EcorV, StuI y PvuIl. Estas secuencias comprendieron a fragmentos desde 300 a 900pb, tal como se describe en la Tabla 8. La Figura 14 muestra el resultado del PCR primario para la Biblioteca DraI empleando los iniciadores AGRO F1 18110 y ADP1. Ccomo se puede observar, se realizó una gradiente de temperaturas (64 a 74°C) y se escogió el amplificado con mayor número de bandas (carril 2 – 63.1°C) para la segunda amplificación. 49 Tabla 8.- Tamaño de los productos amplificados por PCR Genome Walker Iniciadores Dra I (pb) Ecor V (pb) Stu I (pb) Pvu II (pb) AGRO F1 18110 800pb 500pb - - AGRO F3 18411 AGRO R1 4213 - - 450pb 600pb AGRO R2 3951 AGRO 18732 F2' - - 300pb 600pb AGRO 18715 F1' AGRO 3221 R2' 900pb - - - AGRO 3623 R1' AGRO T2M 7090 F - - - 900pb AGRO T2M 7285 F AGRO Acs 121 R - - 500pb 900pb AGRO Acs 245 R λ/PstI 64.6 63.1 66.4 67.9 69.3 70 71.3 72.4 14000 pb 800 pb Figura 14.- PCR primario Librería Dra I. Cada carril corresponde a una temperatura de la gradiente (64.6- 72.4°C); λ/PstI, marcador de tamaño molecular. 50 La Figura 15 muestra el resultado del PCR secundario para la librería Dra I empleando los iniciadores AGRO F3 18411 y ADP2. Esta segunda amplificación es más sensible y específica que la primera ya que se puede observar un solo producto amplificado de 800pb constante a lo largo de la gradiente (63.4 a 70.7°C). λ/PstI 63.4 64.9 64.3 67.0 68.3 69.4 70.4 70.7 14000 pb 800 pb 800 pb Figura 15.- PCR secundario Librería Dra I. Cada carril corresponde a una temperatura de la gradiente; λ/PstI, marcador de tamaño molecular. Posteriormente, se ligaron y clonaron de manera exitosa los 10 fragmentos obtenidos en las reacciones de PCR touchdown previamente descritas. En la Figura 16 se muestra el resultado del análisis de restricción realizado a los vectores plasmídicos pGem-T Easy (Promega) conteniendo el producto del PCR secundario (Librería EcorV) usando los iniciadores AGRO F3 18411 y ADP2. Los plásmidos P1, P2 y P3 contienen el inserto de interés ya que al ser digeridos con la enzima EcoRI se obtuvieron dos fragmentos esperados uno de aproximadamente de 3Kb correspondiente al vector, y otro de 500pb correspondiente al tamaño del inserto. 51 P1 P2 P3 λ/PstI 14000 pb 1700 pb 500pb Figura 16.- Análisis de restricción con EcoRI . Los carriles P1, P2 y P3: corresponden a los plásmidos 1, 2 y 3; λ/PstI, marcador de tamaño molecular. 4.2.4 Análisis de las secuencias obtenidas. Las secuencias nucleotídicas correspondientes a los 10 fragmentos resultantes de las reacciones de PCR Genome Walker fueron ensambladas junto con los 2 contigs descritos anteriormente. Los resultados obtenidos permitieron ensamblar en un solo contig todas las secuencias y además incrementar la longitud de sus extremos. El contig final obtenido comprendió un tamaño de 8123pb e incluyó las secuencias completas de los 4 genes de acuerdo al siguiente orden: Acs, C, iaaH, iaaM y a sus respectivas regiones intergénicas (Figura 17). A esta secuencia completa se le denominó T-DNA de camote. Figura 17.- Mapa génico del T-DNA de camote incluyendo las secuencias obtenidas por PCR Genome Walker . 52 4.3 Filogenia del T-DNA de camote 4.3.1 Secuencia nucleotídica completa: La organización genómica completa es muy similar a: A) Agrobacterium vitis pTiTm4 TB-DNA, con la excepción de que el gen 5 está ausente en el T-DNA de camote y el gen Acs está en diferente orientación (Figura 18). B) Agrobacterium tumefaciens MAFF301001 pTi Sakura, con la excepción de que existe más de un gen adicional entre el gen C e iaaH y además el gen Acs está en diferente orientación (Figura 18). Figura 18.- Organización genómica del T-DNA de camote comparada con las de otras especies del género Agrobacterium . Los resultados de la búsqueda BLASTn se resumen en la Tabla 9. Como se puede observar, los mejores hits (valores de identidad altos e E-value bajos) fueron tres secuencias de Agrobacterium tumefaciens (Números de accesión: AJ237588.1, AE007871.2 y AB016260.1) y una de Agrobacterium vitis (U83987.1), ello basado en los parámetros empleados (query coverage = 55% y E-value de al menos e-50) (Figura 19). El plásmido de la cepa Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58 fue la que presentó mayor porcentaje de cobertura de la secuencia (69%) mientras que Agrobacterium vitis plasmid pTiTm4 obtuvo el menor valor (55%). Ambas secuencias tuvieron porcentajes de máxima identidad 53 similares 70 y 72%, respectivamente. Los E-value obtenidos en todas las secuencias fueron significativos (<0). Colores clave para los resultados del alineamiento AB016260.1 AE007871.2 AJ237588.1 U83987.1 Figura 19.- Resultados del BLASTn de la secuencia completa del T-DNA de camote. Query:Secuencia problema a analizar; AJ237588.1, AE007871.2, AB016260.1 y U83987.1: número de accesiones de los mejores hits encontrados en la base de datos. Tabla 9.-Resultados del BLASTn de la secuencia completa del T-DNA de camote. Número de Query 1 Máx. 3 Descripción E-2 value accesión coverage identidad Agrobacterium tumefaciens Ti AJ237588.1 69% 5e-169 70% plasmid pTiC58 T-DNA region Agrobacterium tumefaciens AE007871.2 68% 5e-169 70% str. C58 plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens AB016260.1 66% 9e-172 70% plasmid pTi-SAKURA DNA Agrobacterium vitis plasmid U83987.1 55% 3e-146 72% pTiTm4 1: Porcentaje de la secuencia problema que ha conseguido encontrarse en la base de datos; 2: Es un valor estadístico que describe el número de alineamientos esperados al azar cuando se busca 54 en una base de datos de tamaño particular; cuanto más bajo es el e-value, es menos probable que sea una similitud por azar.3: Porcentaje de identidad entre la secuencia problema y la secuencia de la base de datos, dentro de la longitud que se ha encontrado. 4.3.2 Análisis filogenético de los genes individuales del T-DNA de camote Para el análisis filogenético de los cuatro genes del T-DNA de camote (Acs, C, iaaH e iaaM), se incluyeron además de las secuencias determinadas en este estudio, otras 26 provenientes del banco de genes del GenBank (Anexo 3), de las cuales 24 correspondieron a cepas del género Agrobacterium y 2 a Pseudomonas syringae, un patógeno de plantas que produce auxinas (Gaffney et al., 1990). El alineamiento de las secuencias correspondientes al gen Acs se muestra en la figura 20, como se puede observar existen regiones conservadas en las secuencias analizadas. Figura 20.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. (*) indica las regiones consenso del alineamiento. La prueba de evaluación de saturación para este gen muestra que las transiciones alcanzan cierto nivel de saturación mas no las transversiones (Anexo N°4). De acuerdo a la opción Model Selection del programa MEGA 5.0, el modelo óptimo para la inferencia filogenética de estas secuencias (BIC: 8610.835) fue el de Kimura 2-parameter (K2+G) cuyo valor (+G) resultó en 0.71. El árbol filogenético NJ resultante (Figura 21), el cual incluyó a cepas de A. tumefaciens y A. vitis muestra que la secuencia del T-DNA de camote para este gen no se agrupa con ninguna de las secuencias analizadas; sin embargo éstas sí se agrupan entre sí en subclados fuertemente soportados, con valores de bootstrap mayores a 90%. 55 Figura 21.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. Los valores de bootstrap calculado para 1000 replicaciones están indicados, mostrándose aquellos mayores al 50%. La escala representa la distancia genética. El alineamiento de las secuencias correspondientes al gen C se muestra en la figura 22, como se puede observar existen regiones conservadas en las secuencias analizadas. Figura 22.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen Acs del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. (*) indica las regiones consenso del alineamiento. La prueba de evaluación de saturación para este gen muestra que las transiciones y transversiones no presentan ningún nivel de saturación (Anexo N°4). El modelo óptimo (BIC: 6797.000) fue el de Kimura 2-parameter (K2+G) cuyo valor (+G) resultó en 1.69. El árbol filogenético NJ resultante (Figura 23), el cual incluyó a cepas de A. tumefaciens y A. vitis, muestra que según el modelo utilizado, la secuencia del T-DNA de camote para este gen no se agrupa con ninguna de las secuencias analizadas. 56 Figura 23.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen C del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. Los valores de bootstrap calculado para 1000 replicaciones están indicados, mostrándose aquellos mayores al 50%. La escala representa la distancia genética. El alineamiento de las secuencias correspondientes al gen iaaH se muestra en la figura 24, como se puede observar existen regiones conservadas en las secuencias analizadas y además eventos de recombinación. Figura 24.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen iaaH del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. (*) indica las regiones consenso del alineamiento. La prueba de evaluación de saturación para este gen muestra que las transiciones presentan cierto nivel de saturación mas no las transversiones (Anexo 4). El modelo óptimo (BIC:11946.458) fue el de Tamura 3-parameter (T92+G) cuyo valor (+G) resultó en 0.68. El árbol filogenético NJ resultante (Figura 25), el cual incluyó además de las secuencias de A. tumefaciens, A. vitis y 57 A. rizhogenes a una de Pseudomonas syringae como out group o grupo externo, muestra que la secuencia de este gen del T-DNA de camote se encuentra más cercanamente relacionada a las secuencias del género Agrobacterium, aunque al igual que en casos anteriores no se agrupa con ninguna de las mismas. La presencia de una secuencia out group para este gen nos permite distinguir cuatro grupos monofileticos dentro del género Agrobacterium, el primero que corresponde al T-DNA de camote, dos conformados exclusivamente por secuencias de A. vitis o A. rhizogenes, respectivamente, y un cuarto que agrupa a secuencias de A. vitis y A. tumefaciens. Figura 25.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen iaaH del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. Los valores de bootstrap calculado para 1000 replicaciones están indicados, mostrándose aquellos mayores al 50%. La escala representa la distancia genética. El alineamiento de las secuencias correspondientes al gen iaaM se muestra en la figura 26, como se puede observar existen regiones conservadas en las secuencias analizadas y además eventos de recombinación. 58 Figura 26.- Alineamiento múltiple de secuencias del gen iaaM del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. (*) indica las regiones consenso del alineamiento. La prueba de evaluación de saturación para este gen muestra que las transiciones presentan cierto nivel de saturación mas no las transversiones (Anexo 4). El modelo óptimo (BIC: 17665.885) fue el de Kimura 2-parameter (K2+G) cuyo valor (+G) resultó ser igual a 1. El árbol filogenético NJ resultante (Figura 27), el cual también incluyó además de las secuencias de las cepas de Agrobacterium a la de Pseudomonas syringae como out group, muestra al igual que en el caso del gen iaaH, pese a estar más cercanamente relacionado al género Agrobacterium, la secuencia del T-DNA de camote no se agrupa con ninguna de las secuencias analizadas. Sin embargo, a diferencia del gen iaaH, este gen se mostraría más conservado dentro del género Agrobacterium pues existe un único clado que agrupa a todas las secuencias de las diferentes especies, estableciéndose dentro de éste tres subclados bien diferenciados que incluyen secuencias de A. vitis, A rizhogenes y de secuencias de A. tumefasciens y A. vitis, respectivamente. 59 Figura 27.- Reconstrucción filogenética basada en el método NJ del gen iaaM del T- DNA de camote y cepas de Agrobacterium relacionadas. Los valores de bootstrap calculado para 1000 replicaciones están indicados, mostrándose aquellos mayores al 50%. La escala representa la distancia genética. 4.4 Hibridación por Southern blot 4.4.1 Extracción de DNA genómico. El método utilizado, CTAB con algunas modificaciones (Manual de Protocolos CIP, 2006), resultó muy efectivo para la extracción de DNA genómico a mediana escala a partir de hojas de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) (2 cultivares) y (4x) (5 entradas), Ipomoea trífida (2x), Ipomoea tabascana (4x) y Solanum tuberosum cv Desireé (control negativo). La Figura 28 muestra los resultados de la calidad de DNA genómico luego de correr 1µL de resuspendido final de la extracción en un gel de agarosa al 1%. La concentración de DNA obtenido varió entre 300- 400ng/µL. 60 1 2 3 4 5 6 λ/PstI Figura 28.-Calidad del DNA genómico. Carril 1: Ipomoea batatas (L.) Lam cv Huachano, Carril 2: Ipomoea batatas (L.) cv Jewel, Carril 3: Ipomoea batatas (L.) Lam (4x), Carril 4: Ipomoea trífida (2x), Carril 5: Ipomoea tabascana (4x) y Carril 6: Solanum tuberosum cv. Desiré; λ/PstI: marcador de tamaño molecular. 4.4.2 Análisis de restricción Los resultados del análisis de restricción identificaron a EcoRI como la enzima óptima para la digestión de las muestras, esto debido a que no es de corte frecuente en el genoma de Arabidopsis thaliana (genera alrededor de 3000 sitios de corte en su genoma) y además posee el menor número de sitios de restricción en el T-DNA (sólo 2 sitios: Posiciones 4072 y 4579pb) (Figura 29). Asimismo, la digestión de las muestras analizadas fue verificada antes de iniciar el proceso de transferencia. 4.4.3 Diseño y marcaje de las sondas La sonda fue diseñada en la región correspondiente al gen C, se ubicó en las posiciones 3112-3565pb, comprendió un tamaño de 775pb y fue obtenida con los iniciadores Ib Cprotein 3F- Ib Cprotein 4R. La Figura 29 muestra el mapa génico del análisis de restricción y la ubicación de la sonda “C 3F-4R “. 61 Figura 29.- Mapa génico del análisis de restricción y ubicación de la sonda diseñada. La sonda gen C 3F-4R fue marcada con DIG mediante una reacción de PCR. En la Figura 30 se muestra la verificación del marcaje de la sonda, observándose que el producto de PCR marcado con DIG (carril 1) presenta un peso molecular superior en aprox. 100pb con respecto al producto de PCR sin marcar (carril 2), cuyo tamaño corresponde a 775pb. λ/PstI 1 2 14000pb 800pb 775pb + DIG 775pb Figura 30.- Verificación de la sonda marcada. Carril 1: Producto de PCR de sonda gen C 3F-4R marcada con DIG, Carril 2: Control negativo sin marcar, λ/PstI: marcador de tamaño molecular. 62 4.4.4 Detección del T-DNA de camote Los resultados obtenidos confirman la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de A. tumefaciens “ T-DNA de camote” en los genomas de I. batatas (L.) Lam (4x y 6x). La Figura 31 muestra el film resultante de la hibridación por Southern blot con la sonda gen C 3F-4R (775pb). El carril 1 corresponde S. tuberosum, mientras que los carriles 2 y 3 corresponden a las especies silvestres I. trífida (2x) e I. tabascana (4x), respectivamente. Estas muestras no registran ningún patrón de bandas, indicando de esta manera la ausencia del T-DNA de camote en sus genomas. Los carriles 4 – 8, corresponden a las muestras de I. batatas (L.) Lam (4x) (1,2,3,4 y 5 respectivamente). De las cinco muestras analizadas se identificó una muestra positiva procedente de Colombia (CIP 403270), con un fragmento EcoRI de 12572pb, las cuatro muestras restantes resultaron negativas. Los carriles 9 y 10 corresponden a I. batatas (L.) Lam (6x) cv Jewel y Huachano, respectivamente. Ambas muestras resultaron positivas y presentan, según el número de fragmentos EcoRI, 4 copias del T-DNA de camote en sus genomas cuyos tamaños corresponden a 11501, 10430, 5791 y 5077pb. 63 EcoRI ≥ 4072 pb λ/PstI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ 12572pb 11501pb 10430pb 5791pb 5077pb 775pb Figura 31.- Análisis de Southern blot de plantas de Ipomoea batatas (L.) Lam y especies silvestres cercanas digeridas con la enzima Eco RI e hibridadas con la sonda gen C 3F-4R . Carril 1: S. tuberosum cv. Desiré, Carril 2: I. trífida (2x), Carril 3: I. tabascana (4x), Carril 4: I. batatas (L.) Lam (4x) –1, Carril 5: I. batatas (L.) Lam (4x) –2, Carril 6: I. batatas (L.) Lam (4x) – 3, Carril 7: I. batatas (L.) Lam (4x) – 4, Carril 8: I. batatas (L.) Lam (4x) – 5, Carril 9: I. batatas (L.) Lam cv Jewel, Carril 10: I. batatas (L.) Lam cv Huachano, C+: Producto de PCR de sonda sin marcar, λ/PstI: marcador de tamaño molecular. El tamaño del fragmento esperado debe ser mayor o igual a 4072 pares de bases. 64 V. DISCUSIÓN 5.1 Identificación y caracterización del T-DNA de camote en Ipomoea batatas (L.)Lam (6x). El desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación masiva en paralelo no sólo ha cambiado el escenario para el análisis de la expresión génica de organismos, sino también ha contribuido a la identificación de nuevos patógenos como virus sin la necesidad de un conocimiento previo, esto fue demostrado en plantas por Kreuze et al., 2009. En dicho trabajo, mediante secuenciación y ensamblaje de pequeños RNAs de interferencia (small interference RNA) “siRNAs”, no sólo se identificaron nuevos virus que infectan al camote sino que además se descubrieron secuencias homólogas al T-DNA de Agrobacterium tumefaciens siendo este hallazgo el punto de partida de la presente tesis. Basados en dichas secuencias se diseñaron iniciadores, utilizados en técnicas de PCR y PCR-Genoma Walker, que finalmente nos permitieron identificar y conocer la organización genómica y extensión de una región de 8123 pares de bases homóloga al T-DNA del plásmido Ti de especies del género Agrobacterium y que además, según ensayos de Southern blot, se encuentra insertada en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) “camote”, en por lo menos 4 copias (11501, 10430, 5791 y 5077pb). A esta región la hemos denominado: “T-DNA de camote”. Mediante búsqueda de homologías en BLASTn se determinó que esta región incluye a los genes: Acs, C, iaaH e iaaM y sus respectivas regiones intergénicas. Este descubrimiento constituye la primera evidencia de transferencia horizontal de genes de origen bacteriano en el genoma de camote y además contribuye a la teoría de que la transferencia horizontal de genes actúa como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Bock, 2010; Richardson y Palmer, 2006; Talianova y Janousek, 2011). El descubrimiento del T-DNA de camote coincide con los resultados obtenidos por White et al. (1983) quienes detectaron por primera vez secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de A. rizhogenes A4b en el genoma de una planta no transformada de N. glauca, a la cual denominaron T-DNAc; y Furner et al. (1986), quienes determinaron que las secuencias del T-DNAc en el genoma de 65 N. glauca estaban organizadas en la forma de una repetición invertida imperfecta de cerca de 13Kb de longitud, y además confirmaron la presencia de esta secuencia en otras especies del género Nicotiana. Asimismo, otros trabajos también han reportado la existencia de secuencias similares al T-DNA de Agrobacterium en otras especies vegetales fuera de este grupo taxonómico, tales como Daucus carota “zanahoria”, la cual contiene secuencias homólogas al T- DNA del pRi1855 (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis cuyo genoma ha registrado secuencias homólogas al T-DNA de pRi8196 (Tepfer, 1984). Si bien la presencia de secuencias homólogas al T-DNA de Agrobacterium ha sido reportada en por lo menos cuatro genomas de plantas superiores (incluyendo camote) el origen eucariota o procariota de esta secuencia aún es desconocido. Sin embargo, existen dos posibles hipótesis, basadas principalmente en los estudios llevados a cabo en el género Nicotiana, que podrían explicar la ocurrencia de este evento. La primera fue propuesta por White et al. (1983) quienes sostienen que probablemente en la evolución de la interacción Agrobacterium-planta la bacteria haya capturado genes de la planta, los cuales se hayan reinsertado de nuevo dentro del genoma de la planta; y la segunda, propuesta por Furner et al. (1986), sostiene que en las primeras etapas de la evolución del género Nicotiana una infección de Agrobacterium a la planta resultó en la introducción del T-DNA dentro de su genoma. Con el fin de determinar la presencia y distribución de esta secuencia dentro de la especie Ipomoea batatas (L.) Lam (6x), se evaluaron mediante pruebas de PCR 87 cultivares de camote procedentes de diferentes países de América, Africa, Oceanía y Asia, donde se cultiva esta raíz. Los resultados obtenidos fueron positivos para todas las muestras analizadas, lo cual evidencia que la presencia de esta región no corresponde a un fenómeno ocurrido al azar en un solo cultivar, sino que su distribución está generalizada en todos los camotes (6x). En vista de estos resultados, nosotros sugerimos que la transferencia de genes desde Agrobacterium al genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) puede haber precedido a su especiación, tal como lo sugiere Furnert et al. (1986) para el caso del T-DNAc de N. glauca. Adicionalmente, estos resultados también han demostrado que la presencia de los genes del T-DNA de camote en todas las muestras analizadas no es homogénea, habiéndose reportado la 66 presencia de un indel (inserción/deleción) de 901pb en la región correspondiente al gen iaaM en el cultivar Huachano, no siendo registrada en ninguno otro cultivar más. Este tipo de reordenamientos coincide con los registrados por Intrieri y Buiatti (2001), en las secuencias del T-DNAc de especies del género Nicotiana; ellos identificaron eventos de duplicación y deleción en los genes estudiados. En vista de la alta incidencia de transferencia horizontal de genes hacia el genoma de plantas, algunos autores como Kejnovsky et al. (2009) han sugerido que la ocurrencia de este tipo de eventos en plantas superiores, específicamente en Angiospermas, se deba a que sus genomas son evolutivamente más dinámicos y lábiles que los de los mamíferos, por ejemplo. En ese sentido, características propias del desarrollo y estilo de vida de las angiospermas tales como la plasticidad genética así como la exposición de las líneas germinales a agentes externos hacen de estos organismos candidatos óptimos para la adquisición de genes horizontalmente. Sin embargo, es importante destacar que dentro de este mismo grupo la adquisición de genes no ocurre de manera homogénea, es decir no todas las especies son susceptibles a adquirir genes por esta vía. Ejemplo de ello es la planta modelo Arabidopsis thaliana, en la cual se ha analizado su genoma completo y no se ha detectado ningún evento de transferencia de genes. Algunos autores como Talianova y Janousek (2011) sugieren que esto se deba a la existencia de factores específicos de la especie (por ejemplo, diversas asociaciones con otras especies, tiempo de vida, vulnerabilidad a patógenos) que incrementen o disminuyan la probabilidad de ocurrencia de este tipo de eventos. En el caso del presente trabajo, el cultivo de camote presenta características agrícolas singulares que se podrían sugerir como factores que le permiten interactuar con diversos patógenos (virus, bacterias), y por ende incrementar la probabilidad de adquisición de genes foráneos. Estos factores incluyen a su ciclo de vida (semestral), su adaptabilidad a diversos pisos ecológicos (0-2500 m.s.n.m.), tolerancia a estres bióticos y abióticos, su propagación clonal por medio de esquejes (Bradshaw, 2010). 67 5.2 Identificación y caracterización del T-DNA de camote en especies silvestres cercanas a Ipomoea batatas (L.) Lam (6x). El origen de la poliploidía así como la identidad del ancestro silvestre del camote hexaploide (2n=6x=90) todavía se encuentran en debate. Trabajos como los de Bohac et al. (1993) reportaron la existencia de camotes silvestres tetraploides (2n = 4x = 60) basado en el análisis de datos morfológicos y conteo de cromosomas. Si bien la existencia de estos camotes silvestres es aún controversial, nosotros decidimos incluirlos en este análisis debido a que podrían dilucidar algunas incógnitas acerca del linaje evolutivo de este cultivo. De manera similar, las especies silvestres Ipomea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x) han sido señaladas como las más cercanas y probables progenitores de I. batatas (L.) Lam. (6x), ello basado tanto en el análisis de datos morfológicos (Austin 1977, 1987), marcadores moleculares (RFLP, RAPD, y SSR) (Jarret et al.,1992; Jarret y Austin, 1994; Buteler et al.,1999) y citogenética molecular (Srisuwan et al., 2006), por lo que también fueron incluidas en este análisis. Los resultados obtenidos por PCR evidenciaron la ausencia de secuencias homólogas al T-DNA de camote en las especies silvestres I. trifida (2x) e I. tabascana (4x), así como en las entradas tetraploides, estos resultados fueron confirmados por Southern blot para casi todas las muestras excepto para I. batatas (L.) Lam. (4x) (CIP 403270) procedente de Colombia. Los perfiles de hibridación obtenidos evidenciaron la existencia de una sola copia (12572pb) del T-DNA de camote en I. batatas (L.) Lam (4x) lo cual difiere marcadamente del perfil obtenido en I. batatas (L.) Lam (6x) que posee por lo menos 4 copias (11501, 10430, 5791 y 5077pb). Esta variabilidad, tanto en número de copias como en el tamaño de los fragmentos EcoRI obtenidos, se le puede atribuir a la presencia de algún tipo de reordenamientos génicos tales como duplicaciones, inserciones y/o deleciones presentes en la secuencia analizada; aún así, estos hallazgos demuestran que ambos grupos de camotes (4x y 6x) comparten una secuencia génica común que no está presente en las otras dos especies silvestres señaladas como más cercanas (I. trífida e I. tabascana) (Austin 1977, 1987; Jarret et al.,1992; Jarret y Austin, 1994; Buteler et al.,1999; Srisuwan et al., 2006). Debido a la importancia de este hallazgo y a que aún la existencia de estos camotes silvestres es controversial, la identidad de las muestras incluidas en esta 68 tesis ha sido verificada por marcadores moleculares (AFLP’s) y conteo de cromosomas (Comunicación personal Dra. Rossel, Curadora de camote CIP). La detección del T-DNA de camote en I. batatas (L.) Lam. (4x) procedente de Colombia nos sugiere seguir investigando la presencia/ausencia de estos genes y su distribución en otros ejemplares de camotes tetraploides y otras especies silvestres relacionadas, especialmente los provenientes de América Central y del Sur ya que esta región es considerada centro de origen de esta especie (Austin, 1977; 1987), ello con el fin de ayudar a elucidar el linaje evolutivo de este género. Asimismo, estos estudios también podrían resolver algunas incógnitas acerca del origen de esta secuencia, tales como conocer si la infección inicial de Agrobacterium hacia el genoma de camote y/o sus parientes silvestres ocurrió en un solo evento o fue múltiple. En el caso de especies del género Nicotiana insertadas con T-DNAc de A. rizhogenes, la hipótesis predominante es la ocurrencia de ambos eventos (mono y múltiple) (Intrieri y Buiatti, 2001). 5.3 Filogenia del T-DNA de camote El análisis de la organización genómica del T-DNA de camote revela que esta es similar al TB-TDNA del plásmido Ti de A.vitis (cepa Tm4) y a los T-DNAs del plásmido Ti de A.tumefaciens (cepas MAFF301001 y C58), coincidiendo ello con los datos obtenidos mediante la búsqueda BLASTn, los cuales le confieren valores de similaridad del 72, 70 y 70%, respectivamente. Sin embargo, estos valores son considerados bajos ya que el porcentaje de cobertura de todas las secuencias analizadas fue menor al 70%. Esta baja similitud coincide con lo propuesto por Otten et al. (1992) y Tzfira y Citovsky (2008) quienes sugieren que la baja variabilidad presente en las secuencias de los plásmidos Ti (incluyendo la de los T-DNAs), se debe a que éstos están compuestos por secuencias homólogas y no homólogas, considerándose, por lo tanto, como un mosaico evolutivo. Por esta razón, y con el fin de realizar un análisis más detallado de la historia evolutiva de estos genes, nosotros decidimos realizar la reconstrucción filogenética de cada uno de los genes individuales: Acs, C, iaaH e iaaM (Figuras: 21, 23, 25 y 27). Los resultados obtenidos en estos análisis demostraron que si bien la secuencia del T-DNA de camote no forma clados fuertemente soportados 69 con los T-DNAs de los plásmidos Ti de Agrobacterium spp. (A. tumefaciens y A. vitis), ésta se encuentra filogenéticamente más cercana a dichas secuencias. Esto último se confirma en los análisis de los genes iaaH e iaaM, en las que se incluyó una secuencia out group (secuencias pertenecientes a Pseudomonas syringae) en la reconstrucción filogenética y de cuyos árboles se pudo inferir además que los genes iaaH e iaaM varian en su comportamiento evolutivo mostrándose más variable y más conservadas, respectivamente. Adicionalmente, las topologías de los árboles observados demuestran que muchos de los clados fuertemente soportados agrupaban tanto a cepas de A. tumefaciems como a las de A. vitis, lo cual evidencia la transferencia horizontal de genes del T-DNA entre los plásmidos Ti de estas especies bacterianas emparentadas, tal como lo reportan Tzfira y Citovsky (2008). Los hallazgos obtenidos hasta esta etapa, basados en la organización genomica, búsqueda Blastn y analisis filogenético de los genes individuales, nos permiten inferir que las secuencias del T-DNA de camote se encuentran filogenéticamente más cercanas a las procedentes del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. Sin embargo, debido a la gran variabilidad en cuanto a las estructuras de los T-DNAs y a la evidencia de que estas regiones se transfieren horizontalmente, no ha sido posible determinar el tipo plasmido Ti del cual proviene la secuencia de T-DNA encontrada en camote. 5.4 Posible rol del T-DNA de camote en el genoma de especies del género Ipomoea . Las funciones de los genes del T-DNA de camote en el genoma de la planta de camote son aún desconocidas. Otten et al. (1999) identificaron las funciones de del gen C a través de ensayos de mutación e infección en Kalanchoe tubiflora, determinando así que la función de este gen está relacionada con la inducción del desarrollo de meristemos. Asimismo, Klee et al. (1987) determinaron la función de los genes iaaH e iaaM mediante el desarrollo de plantas transgénicas de petunias, ellos demostraron que éstas presentaban un incremento en los niveles de auxinas en comparación con los controles de plantas no transformadas y además el desarrollo de anormalidades (raíces adventicias, dominancia apical extrema y hojas enrolladas. Otros trabajos como los de Van Der Graaff et al. (2003) señalan 70 incluso que plantas transgénicas iaaH/iaaM que crecen bajo condiciones de cultivo por un tiempo prolongado muestran engrosamiento y crecimiento ectópico de raíces. Estos hallazgos sugieren la hipótesis de que la inserción del T-DNA de camote podría haber contribuido a la especiación dentro del género Ipomoea debido a que algunos síntomas de plantas transformadas con estos genes podrían conferir alguna ventaja adaptativa (por ejemplo, el engrosamiento de raíces). Sin embargo, esta hipótesis debería ser verificada con estudios de marcadores moleculares asociados a los genes del T-DNA de camote, marcadores morfológicos y análisis de la expresión de estos genes en diferentes tejidos y estadios de desarrollo de la planta. 71 VI. CONCLUSIONES 1. Se identificó una región de 8123pb homóloga al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. , la cual incluye a los genes: Acs, C, iaaH e iaaM y sus respectivas regiones intergénicas, insertada en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) cv Huachano a la cual se ha denominado “T-DNA de camote”. 2. Se confirmó la presencia del T-DNA de camote en 86 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) adicionales, provenientes de diferentes países donde crece este cultivo. 3. Se identificó la presencia del T-DNA de camote en una entrada (4x) de Ipomoea batatas (L.) Lam (CIP 403270) y la ausencia de la misma en las especies silvestres Ipomoea trífida (2x) e Ipomoea tabascana (4x). 4. La secuencia del T-DNA de camote está presente en al menos 4 copias dentro del genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x) cv Huachano y en al menos 1 copia en la entrada (4x) de Ipomoea batatas (L.) Lam (CIP 403270). 72 VII. RECOMENDACIONES 1. Identificar otros genes del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. insertadas en el genoma de camote mediante la técnica de PCR-Genome Walker. 2. Evaluar la presencia del T-DNA de camote en otras entradas (4x) de Ipomoea batatas (L.) Lam y especies silvestres relacionadas con énfasis en las procedentes de América del Sur y Central. 3. Evaluar la expresión de los genes identificados del T-DNA de camote en diferentes tejidos y tiempo de desarrollo de la planta. 73 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Akiyoshi, D.E.; Klee, H.; Amasino, R.M.; Nester, E.W.; Gordon, M.P. 1984. T- DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 81: 5994–5998. 2. Austin, D.F. 1977. Hybrid polyploids in Ipomoea section Batatas. J. Hered. 68:259-260. 3. Austin, D.F. 1988. The taxonomy, evolution and genetic diversity of sweet potatoes and related wild species. In: Exploration, maintenance and utilization of sweetpotato genetic resources. Report of the First Sweet Potato Planning Conference 1987. International Potato Center, Lima, Peru. Pp. 27-59. 4. Ballas, N.; Citovsky, V. 1997. Nuclear localization signal binding protein from Arabidopsis mediates nuclear import of Agrobacterium VirD2 protein. Proc Natl Acad Sci USA. 94:10723-28. 5. Barrau L'Enigme de la patate douce en Oceanie. 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The Plant Journal 23: 11-28. 85 ANEXOS Anexo N°1 Lista de muestras de DNA de 87 cultivares de Ipomoea batatas (L.) Lam (6x). Número de Nombre Código Nombre de País Accesión Género de "Tesis" Accesión de origen CIP especie 1 CIP 440205 Unknown China Ipomoea L. I. batatas 2 CIP 440145 CMR 1112 Camerún Ipomoea L. I. batatas 3 CIP 440146 CMR 1592 Camerún Ipomoea L. I. batatas Aparecido 4 CIP 400578 Cuba Ipomoea L. I. batatas Manchado 5 CIP 400632 Santiaguero Cuba Ipomoea L. I. batatas República 6 CIP 400822 Canabacoa Ipomoea L. I. batatas Dominicana Hoja de República 7 CIP 400830 Ipomoea L. I. batatas Pancho Dominicana Camote 8 CIP 401111 Guatemala Ipomoea L. I. batatas Morado Camote 9 CIP 401104 Guatemala Ipomoea L. I. batatas Naranja 11 CIP 440222 Sumatra Indonesia Ipomoea L. I. batatas 12 CIP 440283 BIS 50 Indonesia Ipomoea L. I. batatas Manchester 13 CIP 400040 Jamaica Ipomoea L. I. batatas Hawk 14 CIP 441169 So 272 Islas Salomón Ipomoea L. I. batatas Regional de 15 CIP 401212 México Ipomoea L. I. batatas Tehuantepec Colección 16 CIP 401215 México Ipomoea L. I. batatas Tierra Blanca 500 (PI 18 CIP 440398 Nueva Zelanda Ipomoea L. I. batatas 308201) 19 CIP 401243 Amarilla Panamá Ipomoea L. I. batatas 86 20 CIP 401248 Amarillo Panamá Ipomoea L. I. batatas 21 CIP 440160 Philippine Filipinas Ipomoea L. I. batatas 22 CIP 440163 Mugande Ruanda Ipomoea L. I. batatas Ngiriare (ACC 23 CIP 440202 Islas Salomón Ipomoea L. I. batatas 275) 24 CIP 440360 Iqui (ACC 78) Islas Salomón Ipomoea L. I. batatas Man Sai 25 CIP 440197 Tailandia Ipomoea L. I. batatas Daeng 26 CIP 440343 Unknown Tailandia Ipomoea L. I. batatas 27 CIP 440241 Yi Lang Red Taiwán Ipomoea L. I. batatas 28 CIP 440165 Kawogo Uganda Ipomoea L. I. batatas 29 CIP 440166 Tanzania Uganda Ipomoea L. I. batatas 30 CIP 401403 Morado Venezuela Ipomoea L. I. batatas 31 CIP 401396 unknown Venezuela Ipomoea L. I. batatas San Vicente y 32 CIP 440267 Hung Loc 4 Ipomoea L. I. batatas las Granadinas 33 CIP 441724 Cuitzeo México Ipomoea L. I. batatas 34 CIP 441726 Tacarigua Venezuela Ipomoea L. I. batatas Blanco 35 CIP 441729 Ecuador Ipomoea L. I. batatas Ecuatoriano Camote 36 CIP 401055 Guatemala Ipomoea L. I. batatas Blanco 37 CIP 440274 Kaloti Tonga Ipomoea L. I. batatas 38 CIP 440277 Siale Tonga Ipomoea L. I. batatas 39 CIP 440294 Totokoitu Islas Cook Ipomoea L. I. batatas 40 CIP 440390 TIS 87/0087 Nigeria Ipomoea L. I. batatas 41 CIP 400176 Oglliri Bolivia Ipomoea L. I. batatas 42 CIP 400458 Blanca de Sal Colombia Ipomoea L. I. batatas 43 CIP 400171 Amarillo Bolivia Ipomoea L. I. batatas 44 CIP 400176 Oglliri Bolivia Ipomoea L. I. batatas 45 CIP 400450 Bogotana Venezuela Ipomoea L. I. batatas 46 CIP 400458 Blanca de Sal Colombia Ipomoea L. I. batatas 87 47 CIP 400578 Manchado Cuba Ipomoea L. I. batatas 48 CIP 400584 Bonito Cuba Ipomoea L. I. batatas 49 CIP 401152 Rojo Honduras Ipomoea L. I. batatas 50 CIP 401154 Unknown Honduras Ipomoea L. I. batatas 51 CIP 401169 Herbie Jamaica Ipomoea L. I. batatas 52 CIP 401223 Cubano Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 53 CIP 401224 Camote Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 54 CIP 401225 Camote Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 55 CIP 401226 C-15 Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 56 CIP 401227 CEMSA-74-228 Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 57 CIP 401228 Batata Morada Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 58 CIP 401253 Camote Panamá Ipomoea L. I. batatas 59 CIP 460397 - Nicaragua Ipomoea L. I. batatas 60 CIP 400002 Morado Ecuador Ipomoea L. I. batatas 61 CIP 400010 226 México Ipomoea L. I. batatas 62 CIP 400020 No 2743 Venezuela Ipomoea L. I. batatas 63 CIP 400023 Col. 633 Guatemala Ipomoea L. I. batatas LOVERs San Vicente y 64 CIP 400025 NAME las Granadinas Ipomoea L. I. batatas Republica 65 CIP 400028 Violáceo Ipomoea L. I. batatas Dominicana 66 CIP 400030 Brasilera Paraguay Ipomoea L. I. batatas 67 CIP 400032 Yety Aba Paraguay Ipomoea L. I. batatas República 68 CIP 400034 Unknown Ipomoea L. I. batatas Dominicana Manchester 69 CIP 400040 Jamaica Ipomoea L. I. batatas Hawk Camote 70 CIP 420509 Perú Ipomoea L. I. batatas amarillo 71 CIP 420617 Chilpo Blanco Perú Ipomoea L. I. batatas 88 72 CIP 440012 W - 217 Estados Unidos Ipomoea L. I. batatas 73 CIP 440011 W - 216 Estados Unidos Ipomoea L. I. batatas 74 CIP 440024 Yanshu 1 China Ipomoea L. I. batatas 75 CIP 440034 Mohc Burundi Ipomoea L. I. batatas 76 CIP 440052 Margarita Puerto Rico Ipomoea L. I. batatas 77 CIP 440116 Gokoku-imo Japón Ipomoea L. I. batatas Papua Nueva 78 CIP 440129 Ma'alua Ipomoea L. I. batatas Guinea 79 CIP 440143 CMR 048 Camerún Ipomoea L. I. batatas 80 CIP 440144 CMR 502 Camerún Ipomoea L. I. batatas 81 CIP 440214 BIS 99 Indonesia Ipomoea L. I. batatas 82 CIP 440222 Sumatra Indonesia Ipomoea L. I. batatas 83 CIP 440241 Yi Lang Red Taiwán Ipomoea L. I. batatas 84 CIP 440295 Seranggoon Malasia Ipomoea L. I. batatas Papua Nueva 85 CIP 440305 Tawa-1 Ipomoea L. I. batatas Guinea 86 CIP 440348 Kao Tailandia Ipomoea L. I. batatas 87 CIP 420065 Huachano Perú Ipomoea L. I. batatas 89 Anexo N° 2 Lista de muestras de DNA de 5 entradas d e Ipomoea batatas (L.) Lam (4x). Código Número de Número de País Nombre de "Tesis" Accesión Género colecta de origen especie CIP CIP 1 DLP 1818 Colombia Ipomoea L. I. batatas 403248 CIP 2 DLP 1843 Colombia Ipomoea L. I. batatas 403261 CIP 3 DLP 1874 Colombia Ipomoea L. I. batatas 403270 CIP 4 DLP 5283 Ecuador Ipomoea L. I. batatas 403552 CIP 5 DLP 2949 México Ipomoea L. I. batatas 403969 90 Anexo N° 3 Número de accesión GenBank de cepas de A. tumefaciens, A. vitis, A. rizhogenes y Pseudomonas syringae. Número de accesión Descripción Genbank Agrobacterium tumefaciens plásmido pTi-SAKURA AB016260.1 DNA, secuencia completa cepa: MAFF 301001. Agrobacterium tumefaciens str. C58 plásmido Ti, AE007871.2 secuencia completa. Agrobacterium tumefaciens Ti plásmido pTiC58 región AJ237588.1 T-DNA. Agrobacterium vitis plásmido pTiTm4, secuencia AF126447.1 completa. Agrobacterium rhizogenes cepa ATCC 15834, plásmido DQ782955.1 pRi 15834, secuencias parciales iaaH e iaaM. Agrobacterium rizhogenes, secuencias parciales iaaH e M61151.1 iaaM. A.tumefaciens (C58) acs gene for agrocinopine Z29717 synthase. Agrobacterium vitis plasmid pTiCG474 agrocinopine synthase, (5), and (iaaH) genes, (iaaM) pseudogene, U83986.1 (ipt) and (6b) genes, and (ocs) pseudogene, complete cds. Agrobacterium tumefaciens agrocinopine synthase M91189.1 gene, complete cds. Agrobacterium vitis plasmid pTiTm4 agrocinopine U83987.1 synthase and (5) genes, (iaaH) pseudogene, and (iaaM), (ipt), (6b) and (ocs) genes, complete cds Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58 T-DNA AJ237588.1 region. Agrobacterium tumefaciens str. C58 plasmid Ti, AE007871.2 complete sequence 91 Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58 AF126445.1 agrocinopine synthase (a),B protein (b), C protein (c), C' protein (c'), and D protein (d)genes, complete cds. Agrobacterium tumefaciens gene for indole acetamide AB025110.1 hydrolase and tryptophan monooxygenase, complete cds. A.tumefaciens Tm4 Ti plasmid DNA with TA-iaaH X56185.1 interrupted by IS866, TA-iaaM, T-ipt and T-6 genes. Agrobacterium vitis plasmid pTiAT1 iaaH gene for AM745117.1 indole-3-acetamide hydrolase, strain AT1. Agrobacterium vitis plasmid pTiAB4 iaaH gene for AM745118.1 indole-3-acetamide hydrolase, strain AB4. Agrobacterium tumefaciens octopine-type Ti plasmid, AF242881.1 complete sequence. Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiBo542, DQ058764.1 complete sequence. Agrobacterium vitis plasmid pTiAG162 indole-3- AF039169.1 acetamide hydrolase (iaaH) gene, complete cds. Agrobacterium rhizogenes strain ATCC 15834 plasmid pRi 15834 3-indoleacetamide hydrolase (aux2) and DQ782955.1 trytophan 2-monooxygenase (aux1) genes, complete cds. Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58 agrocinopine synthase (acs) gene, partial cds; and 5 AF126446.1 protein (5), indole-3-acetamide hydrolase (iaaH), and tryptophan monooxygenase (iaaM) genes, complete cds. Ti plasmid (A. tumefaciens octopine strain) tms1 gene, K02554.1 complete cds. Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi15955 T-DNA X00493.1 region. Agrobacterium vitis plasmid pTiAT1 iaaM gene for FN669137.1 tryptophan 2-monooxygenase, strain AT1. 92 Agrobacterium vitis plasmid pTiAG162 tryptophan 2- AF061780.1 monooxygenase (iaaM) gene, complete cds. P. syringae tryptophan 2-monooxygenase (iaaM) and M11035.1 indoleacetamide hydrolase (iaaH) genes, complete cds 93 Anexo N°4 Distribución de transiciones y transversi ones de las secuencias nucleotídicas de los genes Acs, C, iaaH e iaaM.  Distribución de transiciones y transversiones de las secuencias nucleotídicas del gen Acs con respecto a la distancia genética con el modelo de saturación nucleotídica F84. Nótese que las transiciones presentan cierto nivel de saturación mas no las transversiones. V: Transversiones; S: Transiciones.  Distribución de transiciones y transversiones de las secuencias nucleotídicas del gen C con respecto a la distancia genética con el modelo de saturación nucleotídica F84. Nótese que las transiciones y transversiones no presentan ningún nivel de saturación. V: Transversiones; S: Transiciones. 94  Distribución de transiciones y transversiones de las secuencias nucleotídicas del gen iaaH con respecto a la distancia genética con el modelo de saturación nucleotídica F84. Nótese que las transiciones presentan cierto nivel de saturación mas no las transversiones. V: Transversiones; S: Transiciones.  Distribución de transiciones y transversiones de las secuencias nucleotídicas del gen iaaM con respecto a la distancia genética con el modelo de saturación nucleotídica F84. Nótese que las transiciones presentan cierto nivel de saturación mas no las transversiones. V: Transversiones; S: Transiciones. 95 Anexo N°5 Reactivos para extracción de DNA  Buffer de extracción CTAB 2X Cantidad para 1 Compuesto litro CTAB (bromuro de cetil-trimetil-amonio) 20g NaCl 81.8 g EDTA 0.5M pH 8.0 40ml Tris-HCl 1M pH 8.0 100ml PVP (polivinil pirrolidona) 10g H2O (d) c.s.p 1000ml Nota: El CTAB y el PVP se agregan cuando la solución está caliente y luego de haber agregado todos los demás componentes.  Solución de lavado I Concentración Compuesto Cantidad para 500ml final Etanol absoluto 76 % 380ml Acetato de sodio 1M 0.2M 40ml H2O (d) 80ml  Solución de lavado II Concentración Compuesto Cantidad para 500ml final Etanol absoluto 76 % 380ml Acetato de sodio 1M 10mM 5ml H2O (d) 115ml 96 Anexo N°6 Formulaciones  TBE 10X Compuesto Cantidad para 1 litro Trizma Base 108g Acet Acido bórico 55g EDTA 0.5M pH 8.0 40g H2O (d) 1000 ml Nota: TBE 1X, se realiza una dilución de 1ml. de TBE 10X con 9 ml de agua destilada.  SALB 10X Compuesto Cantidad para 50 ml Azul de Bromo fenol 75 mg Xilen cianol 75 mg Naranja G 100 mg Sucrosa 30 gr TBE 10X 2.5 ml H2O (d) 50ml  Geles De Agarosa 1% Volumen del 40 ml 100 ml 250 ml gel TBE 1X Bromuro de 40 ml 100 ml 250 ml Etidio 0.4 ml 1.0 ml 2.5 ml (10mg/ml) 0.4 gr 1.0 g 2.5 g Agarosa Nota: Se corre en buffer TBE1X en volumen apropiado. 97 Anexo N° 7 Soluciones utilizadas para la Transfere ncia Southern blot   Ácido clorhídrico 0.25M Compuesto Concentración final Cantidad para 1 litro HCl 0.25 M 20.8ml H2O (d) c.s.p 1000ml  Solución Denaturante Compuesto Concentración final Cantidad para 1 litro Na OH 0.50 M 20.00 g NaCl 1.50 M 87.00 g  Buffer de Neutralización (Ajustar a pH 8.0) Compuesto Concentración final Cantidad para 1 litro Tris 1.00 M 121.14 g NaCl 1.50 M 87.00 g  SSC 20X (Ajustar a pH 7.0 con NaOH concentrado) Compuesto Concentración final Cantidad para 1 litro Citrato de sodio tribásico 0.30 M 88.23 g dihidratado 3.00 M 174.00 g NaCl 98 Anexo N°8 Soluciones DIG Easy Hyb (ROCHE) Lavados de Astringencia  Lavado I Concentración Compuesto Cantidad para 200ml final SDS 10% 0.1% 2ml 20x SSC 2x 20ml  Lavado II Concentración Compuesto Cantidad para 200 ml final SDS 10% 0.1% 2ml 20x SSC 0.1% 1ml Soluciones de Detección  Buffer de lavado (Ajustar a pH 7.5 con NaOH concentrado). Concentración Compuesto Cantidad para 1 litro final Ácido Maleico 0.1 M 15.61 g (C4H5O5Na) 015 M 8.8 g NaCl 0.3% 3 ml Tween 20 99  Solución de Bloqueo 10X Compuesto Concentración final Cantidad para 100 ml Blocking reagent 10% 10 g (Roche) Nota: Solución de Bloqueo 1X (100ml), se realiza una dilución de 10ml de Solución de Bloqueo 10X con 90ml de buffer Ácido Maleico.  Buffer Ácido Maleico (Ajustar a pH 7.5 con NaOH concentrado). Concentración Compuesto Cantidad para 1 litro final Ácido Maleico 0.1 M 15.61 g (C4H5O5Na) 015 M 8.8 g NaCl  Buffer de Detección (Ajustar a pH 9.5 con HCl concentrado). Concentración Compuesto Cantidad para 1 litro final Tris – HCl 0.1 M 12.1 g NaCl 0.1 M 5.84 g 100