UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA UNIDAD DE POST-GRADO Uso de dos Análogos de Superóxido Dismutasa para prevenir la Desestabilizaciòn Espermática Prematura durante la Criopreservación y Vitrificación en espermatozoides de Alpaca TESIS Para optar el Grado Académico de Doctor en Medicina Veterinaria AUTOR Mg. Alexei Vicent Santiani Acosta Lima – Perú 2012 DEDICATORIAS A Dios, por cada día que me regala para seguir disfrutando esta vida con la cual he sido bendecido. A la memoria de mi madre, quien brindo todo su tiempo, su amor y su vida por sus hijos y aún desde el cielo continúa guiando cada uno de mis pasos. A mi padre, por todo su apoyo, todo su cariño y sus sabios consejos A Shirley, mi compañera, quien a mi lado sabe apoyarme en todo momento, sabe alentarme a seguir adelante, sabe levantarme cuando se presentan obstáculos en mi camino y sabe alegrarse por cada uno de mis pequeños éxitos. A mis hijitas María Isabel y Sofía Fernanda, los motivos que hacen que tanto trabajo y esfuerzo tenga sentido en esta vida, quienes con unas dulces palabras, una sonrisa, un abrazo ó un beso pueden alegrar mi existencia en cualquier circunstancia. A mi hijo Daniel Alejandro, quien acaba de llegar a este mundo, y su sola presencia es suficiente para darme más fuerza y energía para salir adelante con mi familia. Daniel, se que nos brindarás muchas alegrías. ii AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) por haberme otorgado el financiamiento para poder realizar mis estudios de doctorado. Al IVITA-Maranganí por haberme acogido unos meses para realizar mis experimentos y por las experiencias compartidas. Un reconocimiento especial al Ing. Juan Olazábal por su tiempo y compromiso en sacar adelante este proyecto. A la Dra. Martha Valdivia de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM, por integrarme en su equipo para realizar investigaciones conjuntas y que gracias a ello pude obtener las muestras para este trabajo. Al Centro de Biotecnología de la Reproducción (CEBIOR) de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile, por haberme apoyado en la realización de mis experimentos en citometría de flujo. Un reconocimiento especial a la Dra. Jennie Risopatrón quien fue la artífice de que pudiera compartir nuevamente un tiempo en mi querida ciudad de Temuco. Gracias a Carolina, Osvaldo y Paola por haber dedicado su valioso tiempo en apoyarme con mi trabajo. A cada unos de mis tesistas, amigos y alumnos que a lo largo de estos años han contribuido con su esfuerzo y tiempo en ir culminando cada uno de mis experimentos. Gracias Jorge Banda, Gino Carlotto, Ricardo Castillo, José Luis Delgado y William Bocanegra. A mi alma mater, la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y al Dr. Víctor Leyva, porque desde hace más de una década me guia en este fascinante mundo de la investigación en la disciplina de la reproducción animal. iii ÍNDICE CONTENIDO Pag. Dedicatorias ii Agradecimientos iii Índice de contenido iv Resumen vi Abstract vii Lista de cuadros viii Lista de figuras x Lista de anexos xii I. INTRODUCCIÓN 1 II. REVISIÓN DE LITERATURA 5 2.1 Fisiología reproductiva en alpaca macho 5 2.1.1. Métodos de colección de semen 6 2.1.2. Características del semen de alpacas 9 2.2 Fisiología del espermatozoide 11 2.2.1. Capacitación espermática 12 2.2.2. Reacción acrosomal 13 2.3 Evaluación de la función espermática 14 2.3.1. Evaluación de la motilidad espermática 14 2.3.2. Evaluación de la integridad funcional de membrana 15 2.3.3. Evaluación de la vitalidad e integridad acrosomal 16 2.3.4. Evaluación de la fragmentación de ADN 17 2.4 Criopreservación de semen 18 2.4.1. Principios de criopreservación 19 2.4.2. Proceso de criopreservación 20 2.4.3. Criopreservación de espermatozoides en alpacas 22 2.4.4. Dilutores y agentes crioprotectores 24 2.4.5. Efectos de la criopreservación en la función espermática 27 2.5 Vitrificación de semen 28 2.6 Especies reactivas de oxígeno 29 iv 2.6.1. Estrés oxidativo seminal 31 2.6.2. Producción de ROS en el semen 31 2.6.3. Efectos fisiológicos de ROS en espermatozoides 32 2.6.4. Efectos patológicos de ROS en espermatozoides 35 2.6.5. Producción de ROS durante criopreservación 39 2.7 Antioxidantes 41 2.7.1. Antioxidantes presente en espermatozoides y plasma seminal 42 2.7.2. Análogos de superóxido dismutasa 45 2.7.3. Efecto de antioxidantes en la función espermática 47 2.7.4. Criopreservación de semen con antioxidantes 50 III. MATERIALES Y MÉTODOS 53 3.1. Lugar de estudio 53 3.2. Animales y muestras biológicas 54 3.3. Fase Experimental 55 3.4. Procedimiento metodológico 58 3.5. Evaluación de características seminales 60 3.6. Análisis estadístico 68 IV. RESULTADOS 69 4.1. Experimento 1: Vitrificación de espermatozoides de alpaca. 69 4.2. Experimento 2: Efecto de ROS en funcionalidad de espermatozoides 72 4.3. Experimento 3: Antioxidantes durante la criopreservación de semen. 72 V. DISCUSIÓN 76 VI. CONCLUSIONES 86 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87 VIII. ANEXOS 111 v RESUMEN El presente trabajo consta de 3 experimentos y tuvo como objetivo principal demostrar el efecto nocivo de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la funcionalidad de espermatozoides de alpacas y evaluar el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa durante la criopreservación de semen. En el Experimento 1, 15 muestras de espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo y 5 muestras de semen de alpaca fueron vitrificadas en medios Tris base y HTF utilizando diferentes azúcares (fructosa, sacarosa y trehalosa) en 3 concentraciones diferentes (0.25, 0.5 y 1.0 M). Sólo se obtuvo menos de 1% de motilidad y menos de 5% de viabilidad utilizando el medio HTF.. En el experimento 2, espermatozoides frescos de alpaca fueron incubados durante 3 horas a 37 °C en un medio Tris-base junto con polimorfos nucleares activados con 100 mM de PMA (Phorbol myristate acetate) para inducir la formación de ROS. Se demostró que la motilidad espermática se reduce significativamente (p< 0.05) en el grupo con inducción de formación de ROS (13.67%) en comparación con el grupo control (22.42%). En el Experimento 3, se evaluó el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante el proceso de criopreservación en un medio en base a leche descremada y etilenglicol, encontrando que con la adición de Tempol 1mM se obtiene una mayor (p<0.05) motilidad espermática en comparación al grupo control (22.08% vs. 11.21%, respectivamente) y se reduce (p<0.05) la fragmentación del ADN (16.72% vs. 38.76%, respectivamente). Las variables espermáticas de función celular como integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal no fueron afectadas significativamente por niveles elevados de ROS, ni su pérdida parcial durante la criopreservación fue prevenida mediante la adición de antioxidantes. Se concluye que las especies reactivas de oxígeno tienen un efecto nocivo en la motilidad de espermatozoides de alpaca, y que durante la criopreservación de semen la pérdida de motilidad espermática e incremento de la fragmentación del ADN espermático puede ser prevenido parcialmente mediante la utilización del antioxidante Tempol 1 mM como parte del dilutor de semen. Palabras clave: Espermatozoides, alpaca, criopreservación, ROS, antioxidante, Tempol. vi ABSTRACT The present study had 3 experiments and the main objectives were to demonstrate the harmful effect of reactive oxygen species (ROS) on alpaca sperm function and to evaluate the effect of two superoxide dismutase mimic (Tempo and Tempol) during sperm cryopreservation. In Experiment 1, vitrification of alpaca sperm was evaluated using extenders based on Tris solution and HTF, with different sugars as cryoprotectants (fructose, sucrose, and trehalose fructose) in different concentrations (0.25, 0.5 y 1.0 M). Only few spermatozoa motile (<1%) and viable (<5%) were found in group HTF. In Experimental 2, fresh alpaca sperm were incubated during 3 hours at 37 °C on a medium based on Tris with polymorphonuclear activated by 100 mM PMA (phorbol myristate acetate) to induce ROS production. Sperm motility was significantly reduced (p< 0.05) when sperm were incubated on a medium con high levels of ROS (13.67%) in comparison with control group (22.42%). In Experiment 3, two superoxid mimics antioxidants (Tempo and Tempol) were evaluated during cryopreservation process on an extender based on skim milk and ethylene glycol. Addition of Tempol 1 mM results in higher (p< 0.05) sperm motility in comparison than control group (22.08 vs. 11.21, respectively). In the same way, DNA fragmentation were lower (p< 0.05) in Tempol group (16.72%) than control group (38.76%). Other sperm function parameters evaluated as functional sperm integrity and viability and acrosomal integrity were not affected by high levels of ROS nor during cryopreservation with superoxide dismutase mimics. We conclude that ROS had a detrimental effect on alpaca sperm motility. We can also conclude that loss of sperm motility and increase of DNA fragmentation during cryopreservation could be partially reduced by administration of Tempol 1 mM as part of the sperm extender. Key words: Sperm, alpaca, cryopreservation, ROS, antioxidant, tempol vii LISTA DE CUADROS Página Cuadro 1 Características microscópicas del semen de camélidos 11 sudamericanos. Cuadro 2 Estudios realizados en criopreservación de espermatozoides de 23 camélidos sudamericano. Cuadro 3 Características biofísicas de los crioprotectores penetrantes 26 Cuadro 4 Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su 42 acción. Cuadro 5 Experimentos y actividades experimentales realizados de acuerdo 53 a la institución de procedencia de las muestras. Cuadro 6 Diluciones realizadas para criopreservación de espermatozoides 59 de alpaca. Cuadro 7 Relación de variables independientes, variables dependientes y 68 pruebas estadísticas utilizadas en cada experimento del presente proyecto. Cuadro 8 Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de 69 espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=6) en una solución Tris base Cuadro 9 Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de 70 semen de alpaca (n=5) en una solución Tris base. Cuadro 10 Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de 71 espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=9) en una solución HTF. viii Cuadro 11 Porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto 71 obtenidos luego de vitrificar muestras de espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=9) en una solución HTF. Cuadro 12 Efecto de la incubación de espermatozoides de alpaca con 72 polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS. Cuadro 13 Efecto de la adición de antioxidantes (Control, Tempo 1mM y 73 Tempol 1mM) durante la curva de enfriamiento (10°C) para la criopreservación de espermatozoides de alpaca sobre la motilidad espermática, integridad de membrana, viabilidad e integridad acrosomal y daño del ADN espermático. Cuadro 14 Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) 74 y variables motilidad, integridad de membrana (HOS+) y vitalidad/integridad acrosomal ix LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 Inicio de peroxidación lipídica en relación a la sustracción de un 37 átomo de hidrógeno de un ácido graso poli-insaturado. Figura 2 Representación esquemática de las vías de peroxidación lipídica. 39 Figura 3 Ciclo redox del glutatión. 45 Figura 4 Diferentes grados de reacción en espermatozoides expuestos al 62 test hipoosmotico. (A: Espermatozoide con membrana alterada/dañada. B, C, D, E, F, G y H: Espermatozoides con integridad funcional de membrana intacta). Adaptado de Jeyendran et al. (1984). Figura 5 Selección y controles de la población de espermatozoides de 66 alpaca para tinción de TUNEL por citometría de flujo. (5ª) Muestra los eventos seleccionados para ser analizados como espermatozoides de alpaca. (5b) Control de autofluorescencia. (5c) Control TUNEL. (5d) Control PI. Figura 6 Espermatozoides de alpaca evaluados mediante microscopia 67 óptica y de fluorescencia con 400X, luego del análisis de citometría de flujo. Espermatozoide de control PI bajo microscopio óptica (Fig.6a) y de fluorescencia (6b). Espermatozoide de control TUNEL bajo microscopio óptica (Fig. 6c) y de fluorescencia (6d). Espermatozoide permeabilizado y con ADN nuclear intacto visto bajo microscopia óptica (Figura 6e) y de fluorescencia (Fig. 6f). Figura 7 Análisis de citometría de flujo para evaluación de la integridad 75 de ADN (TUNEL/PI) en la población de espermatozoides de alpaca criopreservadas por 3 tratamientos: (a) Grupo Control, (b) Grupo Tempo, (c) Grupo Tempol. x LISTA DE ANEXOS Página Anexo 1 Consolidado de machos utilizados para colección de semen, 111 intentos de colección realizados por macho, muestras totales obtenidas y muestras de buena calidad. Anexo 2 Dsitrbución de muestras seminales para ser utilizadas en los 112 experimentos 1 y 3 de acuerdo al macho de procedencia. Anexo 3 Características seminales de las muestras utilizadas en los 113 experimentos 1 y 3. Anexo 4 Efecto del tipo y concentración de azúcares en la motilidad de 114 espermatozoides de alpaca luego del proceso de vitrificación. Anexo 5 Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de 114 alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la motiliad espermática. Anexo 6 Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de 114 alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la integridad funcional de membrana (HOS+). Anexo 7 Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de 115 alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la vitalidad/integridad acrosomal. Anexo 8 Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) 115 en la motilidad de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Anexo 9 Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) 115 en la integridad funcional de membrana (HOS+) de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. xi Anexo 10 Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) 116 en la vitalidad/integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Anexo 11 Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) 116 en la framentación del ADN (TUNEL +) de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Anexo 12 Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) 116 y motilidad espermática. Anexo 13 Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) 117 e integridad funcional de membrana (HOS+). Anexo 14 Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) 117 y vitalidad/integridad acrosomal. xii I. INTRODUCCIÓN La criopreservación de semen es un procedimiento que permite mantener viables a espermatozoides por periodos de tiempo indefinidos mediante el mantenimiento de estas células en temperaturas muy bajas (-196°C en nitrógeno líquido). En algunas especies como camélidos sudamericanos domésticos, llamas y alpacas, su utilización es casi inexistente debido a la falta de información para obtener muestras de buena calidad luego del descongelamiento. En otras especies como bovinos, ésta técnica ha permitido el uso masivo de la inseminación artificial a nivel mundial. Por otro lado, en bovinos es posible seguir encontrando abundante información científica actualizada sobre nuevos procedimientos para mejorar la técnica de criopreservación. Por el contrario, en camélidos sudamericanos, los únicos trabajos detallados sobre criopreservación de espermatozoides de alpaca son los descritos por Santiani et al. (2005), Morton et al. (2007, 2010), Rodriguez (2009) y Banda et al. (2010); mientras que en espermatozoide de llamas se tienen los reportes de Von Baer et al. (1999) y Aller et al. (2003). Adicionalmente encontramos otros trabajos como comunicaciones científicas en resúmenes de eventos científicos como los reportados por Valdivia et al. (2000) en espermatozoides de alpacas; y Graham et al. (1978) y Bravo et al. (1996) en espermatozoides de llamas. Una de las razones por las cuales no existe abundante información sobre criopreservación de semen en estas especies es la dificultad para conseguir muestras de semen fresco de buena calidad; así que algunos de los trabajos anteriormente citados (Morton et al., 2007, 2010; Rodriguez, 2009; Banda et al. 2010; Valdivia et al., 2000) utilizaron espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo como modelo alternativo. Es ineteresante destacar que los parámetros de función 1 espermática en alpacas son similares cuando se realiza criopreservación de muestras de semen o de espermatozoides obtenidos directamente de la cola del epidídimo. En este sentido, se ha demostrado que la presencia del plasma seminal durante la criopreservación de espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo no afecta los parámetros de función espermática (Rodriguez, 2009). En los estudios referidos sobre criopreservación de espermatozoides de camélidos sudamericanos, en alpacas se reportan porcentajes de motilidad espermática alrededor del 20% (Valdivia et al., 2000; Santiani et al., 2005), en forma similar a lo reportado en llamas (Von Baer y Hellemann, 1999; Aller et al., 2003). Es interesante destacar que según los reportes de Banda et al. (2010) y Rodríguez (2009) si bien la motilidad post descongelamiento varia alrededor del 20%, los porcentajes de viabilidad pueden alcanzar rangos de hasta 40 a 50%. Estos resultados indicarían que las células espermáticas han sido desestabilizadas durante los procesos de congelamiento-descongelamiento, alterando la función de motilidad, pero no llegando a causar la muerte celular. Luego de la criopreservación de espermatozoides de alpacas, se reporta una disminución en la motilidad espermática, integridad funcional de membrana, integridad acrosomal, actividad mitocondrial y aumento en la fragmentación del ADN espermático (Santiani et al., 2005; Rodríguez, 2009). Asimismo, en espermatozoides de bovinos (Cormier y Bailey, 2003) y ovinos (Maxwell y Watson 1996; Pérez et al., 1996; Gil et al., 2003) se describe un gran incremento en la proporción de espermatozoides capacitados, es decir aumentan los espermatozoides desestabilizados, por lo cual a este fenómeno se le denomina “criocapacitación”. Estos cambios en la funcionalidad de los espermatozoides podrían explicar el porqué en ciertas especies si bien los espermatozoides sobreviven inicialmente al proceso de criopreservación, no logran finalmente fecundar a los ovocitos y no se producen desarrollo de gestaciones. Uno de los principales factores descritos que afectan la funcionalidad de espermatozoides son niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los principales efectos nocivos de ROS en la funcionalidad espermática son pérdida de motilidad (Peris et al., 2007), incremento de peroxidación lipídica (Aitken, 1994) y fragmentación del ADN espermático (Baker y Aitken, 2004). Asimismo, en diferentes especies como en humanos (de Lamirande y Lamothe, 2009) y porcinos (Awda et al., 2 2009) se ha demostrado que las especies reactivas de oxígeno también inducen la capacitación espermática. Es interesante destacar que en ovinos (Santiani, 2003) y humanos (Wang et al., 1997), se ha demostrado que durante el proceso de criopreservación de semen, los niveles de especies reactivas de oxigeno se incrementan significativamente, estando relacionados con pérdida de motilidad y viabilidad espermática, así como con capacitación espermática prematura (Santiani, 2003; Peris et al., 2007; Ruiz et al., 2007) y fragmentación del ADN espermático (Peris et al., 2007; Sue-Hee et al., 2010). Sin embargo, se ha demostrado que el efecto negativo de los ROS puede ser prevenido parcialmente mediante la adición de antioxidantes análogos a superóxido dismutasa al medio dilutor de semen (Santiani, 2003; Ruiz et al., 2007), mientras que en bovinos, el uso de antioxidantes en los diluyentes para congelar semen aún es controversial (Foote et al., 2002). En alpacas y llamas, no existen estudios sobre el efecto de la producción de especies reactivas de oxígeno en la funcionalidad espermática, ni sobre la utilización de antioxidantes durante el proceso de criopreservación, por lo cual sería interesante demostrar si los ROS afectan negativamente la función del espermatozoide de alpaca y estudiar si la adición de antioxidantes podría prevenir de alguna manera la pérdida de la funcionalidad espermática durante el proceso de criopreservación. Por otro lado, recientemente se ha desarrollado un protocolo de vitrificación para espermatozoides de primates humanos y no humanos (Dong et al., 2009; Isachenko et al., 2008; Hossain et al., 2007) que tiene como ventajas respecto a los protocolos tradicionales de criopreservación, que se realizan rápidamente sin necesidad de utilizar máquinas de congelamiento y evitan el uso de crioprotectores tóxicos para los espermatozoides. En este sentido, la técnica de vitrificación es novedosa, y aún no ha sido estudidad la factibilidad de implementarla en espermatozoides de mamíferos domésticos. Por lo tanto el objetivo principal del presente proyecto fue evaluar el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante los procesos de criopreservación y vitrificación de espermatozoides de alpaca sobre parámetros de funciónalidad espermática. Los objetivos específicos fueron: (1) Evaluar la factibilidad de desarrollar un protocolo de vitrificación de espermatozoides de alpaca en un medio libre de agentes crioprotectores mediante el estudio de disntitos tipos de azúcares; (2) Determinar el 3 daño celular inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS) en espermatozoides de alpaca; y (3) Evaluar el efecto de los ROS en la funcionalidad espermática durante los procesos de criopreservación y vitrificación de espermatozoides de alpaca. 4 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 Fisiología reproductiva en alpacas m achos La hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH) es una hormona sintetizada en el hipotálamo y actúa dentro de la fisiología del macho causando la elevación de la producción de las hormonas folículo estimulante (FSH) y (LH) a nivel hipofisiario, las cuales a su vez tienen un efecto directo sobre la espermatogénesis y sobre la secreción de testosterona (Háfez et al., 2000). La LH es la hormona encargada de estimular la producción de testosterona por las células de Leydig en el estroma testicular (Sutovsky and Manandhar, 2006). En bovinos Holstein, dosis repetidas de GnRH causan un incremento en la producción seminal y las concentraciones de LH y Testosterona (Miller y Amman, 1986). Asimismo, en ovinos producen un incremento en la concentración de testosterona sérica y un incremento de la actividad sexual (Schambancher y Lunstra, 1977; Andaur et al., 2004). Los niveles elevados de testosterona inhiben la secreción de GnRH mediante un mecanismo denominado retroalimentación negativa (O´Donell, et al. 2006). En los túbulos seminíferos se lleva a cabo la espermatogénesis, siendo regulada por las Células de Sertoli, así como por la FSH y testosterona. En alpacas entre 2 a 5 años se aprecia en los túbulos seminíferos un epitelio germinativo distribuido ordenadamente en estratos, con diferenciación de las células germinales en espermatogonias de forma redondeada en la membrana basal, espermatocitos primarios y secundarios en mayor cantidad de forma triangular alargadas y espermatozoides en dirección a la luz del túbulo, las células de Sertoli intercaladas en el epitelio germinal (Rojas, 1998). La producción de espermatozoides. Entre los 6-12 meses de edad, las células germinales empiezan a 5 organizarse en el túbulo seminífero, desplazándose hacia la membrana basal, mientras que las células de Sertoli se elongan y se distancian entre ellas. Las células germinales comienzan a ocupar los espacios entre las células de Sertoli y se organizan en estratos (Pasco, 2001). En machos de 18 meses ya es posible observar espermatozoides maduros, pero en baja concentración. En alpacas, el inicio del comportamiento sexual se observa a partir del primer año de edad (Fernández-Baca et al., 1972), sin embargo, la mayoría de machos presenta adherencias pene prepuciales (Carpio et al., 1999). Los niveles de testosterona en alpacas de menos de 1 año varían entre 0.5 a 1ng/mL, mientras que en machos adultos, la testosterona presenta valores entre 1 a 5 ng/mL (Carpio et al., 1999; Chuna et al., 2000). Se ha descrito que mayores niveles testosterona sérica se relacionan con machos que liberan prematuramente sus adherencias pene prepuciales (Chuna et al., 2000), siendo demostrado mediante la administración exógena de testosterona (San Miguel et al., 2001). 2.1.1. Métodos de colección de semen La colección de semen en camélidos es unos de los principales factores limitantes para el desarrollo de la inseminación artificial en llamas y alpacas, así como para la evaluación de la capacidad reproductiva de los machos (Novoa y Leyva, 1996). Las especiales características reproductivas, anatómicas y fisiológicas de estas especies como son el prolongado tiempo de cópula, el temperamento nervioso, la posición de cópula, lugar de depósito del semen, la eyaculación intracornual y continua, la extrema viscosidad del semen, etc.; determinan una alta dificultad para la colecta de semen, siendo aún inexistente un protocolo recomendado y una técnica óptima (San Martín et al., 1968; Pacheco, 2008). A continuación, se describen los principales métodos descritos para colectar semen en camélidos sudamericanos: 6 Vagina artificial. Esta técnica es una variante de la vagina artificial usada en bovinos y ovinos y fue propuesta por Sumar y Leyva (1981), quienes utilizando u maniquí con forma de la hembra sentada en posición decúbito ventral, simularon la cópula normal. Dentro de este maniquí adaptaron una vagina artificial modificada en su interior. Los machos aceptan el maniquí después de un corto periodo de entrenamiento; logrando obtenerse muestras de semen de características variables según el macho, tiempo de cópula efectiva y número de interrupciones de la misma. Diferentes autores han hecho uso de la vagina artificial con diversas variantes en sus respectivos protocolos de colección de semen. Quispe y Olarte (1988) evaluaron 10 alpacas macho usando el mismo método de colección reportando que los machos le perdían el interés al maniquí, gradualmente, conforme se alejaban de los meses de verano, inhibiéndose por completo en el mes de setiembre. Dávalos y Olazábal (2002) encontraron que el uso de la vagina artificial con la presencia de una hembra receptiva al lado del maniquí aumenta la calidad de los eyaculados colectados, en comparación al uso del maniquí solo, incrementando también el tiempo de cópula. Electroeyaculación. Mediante el uso de un equipo de fabricación nacional, con una intensidad máxima de 40 voltios, Fernández-Baca y Calderón (1966) reportaron la obtención de muestras de semen con las ventajas de realizar la colección sin la necesidad de contar con hembras en celo, acortar el tiempo de colección y realizarla a lo largo de todo el año. La técnica de electroeyaculación consistía en introducir un electrodo bipolar, a una longitud no mayor de 10cm, en el recto del macho objeto de la colecta seminal manteniendo esta posición durante todo el tiempo que dure la aplicación de los estímulos; estos últimos eran aplicados en serie y a intervalos de tiempo definidos consiguiendo la erección del pene y la posterior eyaculación. Toda la operación dura entre 10 y 15 minutos, con considerables variaciones individuales. Este método de colección también se utilizó para obtener semen de vicuñas y pacovicuñas (Fernández-Baca y Novoa, 1968). Los resultados del uso de la electroeyaculación muestran gran variabilidad entre animales y aún en el mismo animal, 7 además de obtenerse semen muy diluido con las secreciones de las glándulas anexas y baja concentración espermática; así mismo esta técnica presenta serias dificultades debido al elevado número de impulsos eléctricos y a la contaminación frecuente del semen con orina emitida durante la estimulación (Fernández-Baca y Calderón, 1966; Raymundo, 2004; Pacheco, 2008). Aspiración vaginal poscoital. También es posible obtener muestras de semen por aspiración del fondo de la vagina después de la cópula, ya que una pequeña cantidad de semen es eyaculada allí, al momento de llevar el pene de un cuerno a otro. Este método no es invasivo ni tedioso, pero la desventaja es que este semen es incompleto, contaminado y diluido con las secreciones del tracto genital de la hembra; sin embargo, se podría usar este método para evaluar parámetros espermáticos como motilidad, morfología y vitalidad. La utilización de este tipo de semen para evaluar la fertilidad del macho es muy cuestionada (Pacheco, 2008). Desviación de los conductos deferentes. Esta técnica consiste en el desvío quirúrgico de los conductos deferentes hacia la cara interna del muslo o la región ventral del animal intentando así, colectar espermatozoides directamente de su reservorio, la cola del epidídimo, sin que estos tengan contacto con las secreciones de las glándulas anexas. A través de la fístula permanente que se genera en la piel luego de la operación se colectan los espermatozoides continuamente. Este método de colección tiene como ventajas el hecho de prescindir de una hembra receptiva para la colecta y contar con muestras de fácil manejo sin los inconvenientes de la viscosidad del semen completo, evitando el uso de enzimas proteolíticas o de la acción mecánica para licuefactar el mismo (Paricahua, 2001; Quintano, 2002). 8 Recuperación de espermatozoides del epidídimo. Este método de colección, de manera análoga a la desviación de los conductos deferentes, tiene como objetivo la colecta de espermatozoides directamente de su reservorio, el epidídimo; sin embargo, es más radical al incluir en su protocolo la extirpación del testículo. La técnica consiste en la separación quirúrgica de las mencionadas gónadas y la escisión de las colas epididimarias respectivas a las que se les extrae los espermatozoides que llevan en su interior usando como medio una solución fisiológica buferada (PBS), obteniendo finalmente una suspensión de espermatozoides que se toma como muestra. Esta técnica está orientada principalmente al rescate del germoplasma de individuos muertos súbitamente, cuyas especies se encuentren en peligro de extinción y cuyas colectas de semen sean difíciles de realizar (Anel et al., 2002); no obstante, la recuperación de espermatozoides epididimarios también se constituye en una herramienta factible de usarla con machos sin valor genético y/o económico como modelos para experimentar diversos efectos en las respuestas biológicas y fisiológicas de los espermatozoides. En camélidos sudamericanos se vienen recuperando espermatozoides epididimarios de llama y alpaca debido a la dificultad para obtener muestras de espermatozoides bajo los diferentes procedimientos descritos anteriormente (Ratto et al., 1999; Morton et al., 2007, 2010). Otros métodos utilizados para colectar semen en camélidos incluyen la utilización de fundas vaginales (Mogrovejo, 1952), esponjas vaginales (San Martín, 1961) y la realización de una fistula uretral (von Kubicek, 1974). 2.1.2. Características del semen de alpacas El semen en camélidos sudamericanos presenta una coloración que puede variar desde el blanco lechoso a blanco cristalino, según la concentración de espermatozoides (Bustinza, 20011); tiene una alta viscosidad, característica que le da un aspecto semejante a un gel y que dificulta su manejo (Garnica et al., 1993). El pH del semen de alpaca es 9 ligeramente alcalino con un promedio de 7.29 y rango de 7.2 a 8.6. La frecuencia de eyaculados no tiene efecto significativo sobre el valor del pH (Mogrovejo, 1952; Fernández-Baca y Calderón, 1966). El volumen de eyaculado es variable y, al igual que la concentración espermática, está influenciado por el método de colección empleado. El promedio del volumen para el eyaculado de alpaca es de 1-2mL, y los rangos van desde menos de 1mL hasta 12.5mL (Gárnica et al., 1993; Sumar y Leyva, 1981). La concentración espermática también es influenciada por la técnica de colección, siendo la vagina artificial el método de colección más usado y confiable con valores alrededor de 100 millones de espermatozoides por mL (Sumar y Leyva, 1981; Bravo et al., 1997; Aller et al., 2003; Raymundo, 2004; Santiani et al., 2005); sin embargo, debemos considerar que se han reportado concentraciones espermáticas mayores al usar una hembra en celo como estímulo para el macho donante sometido a colecta por vagina artificial (Dávalos y Olazábal, 2002). La alta viscosidad del plasma seminal así como la baja concentración espermática determinan patrones de motilidad particulares para el semen de alpaca, en comparación con otras especies. No existe motilidad masal y la motilidad individual es estacionaria u oscilante y no progresiva. Diferentes autores registran variados valores para la motilidad contando con un promedio de 52,4% y rango de 30.6 – 80.0% (Sumar y Leyva, 1981; Bravo et al., 2002; Dávalos y Olazábal, 2002). El porcentaje de espermatozoides anormales para el eyaculado de alpaca es de 25.2% en promedio, contando con un rango de 14 – 41.03% (Mogrovejo, 1952; Bravo et al., 1997; Dávalos y Olazábal, 2002). En el cuadro 1 se presenta una lista con las características seminales tomados de algunos trabajos en espermatozoides de alpacas. 10 Cuadro 1. Características microscópicas del semen de camélidos sudamericanos Método de Concent. Motilidad Vitalidad Anormales Autor colección (x106/mL) (%) (%) (%) Mogrovejo, Funda v. 63-107 - - 41.23 1952 Palomino, Funda v. - - - 11.65 1962 Sucapuca, Funda v. 0.83 - - - 1991 (condón) Fernández B. Electro- 31.68 - - - y Calderón, 1966 eyaculación (1-255) Paricahua, Desviación 51 - 94.25 - 2001 conductos Sumar y Vagina 600 - - - Leyva, 1981 Artificial Vagina Bravo et al., 1997 147.5 85 69.6 24.1 artificial Valdivia et al., Vagina - 60 – 98 - - 1999 artificial Vagina Aller et al., 2003 75,2 12.5 16.5 - artificial Vagina Raymundo 2004 248.1 54 - - artificial Santiani et al., Vagina 80 60 - - 2005 artificial (Cuadro tomado de Banda J, 2009) 2.2 Fisiología del espermatozoide Los espermatozoides, gametos masculinos producidos durante la espermatogénesis, son células elongadas que consisten en una cabeza aplanada que contiene al núcleo y una cola con un sistema que permite la motilidad espermática (Garner y Háfez, 2000). Estas 11 células pueden desarrollar diversos procesos metabólicos como la glicólisis y respiración celular; y procesos fisiológicos como la capacitación espermática y reacción del acrosoma. Los espermatozoides pueden metabolizar la glucosa o fructosa a través de la glicólisis, formando como producto metabólico el ácido láctico. Esta actividad permite a los espermatozoides obtener ATP en condiciones anaeróbicas (Garner y Háfez, 2000). También pueden utilizar una variedad de sustratos en presencia de oxígeno para obtener energía. En la actividad respiratoria se utiliza el lactato o piruvato resultantes de la glicólisis, para producir dióxido de carbono y agua. Este mecanismo oxidativo, que se realiza en las mitocondrias, produce energía más eficientemente que la glicólisis. Utilizando este proceso, los espermatozoides convierten la mayoría de energía producida en ATP. Gran parte del ATP producido es consumido para permitir el movimiento espermático, mientras que otra parte es utilizada para mantener la integridad del proceso de transporte activo de la membrana plasmática. El proceso de transporte activo previene la pérdida de compuestos iónicos del espermatozoide (Garner y Háfez, 2000). 2.2.1. Capacitación espermática La capacitación es el conjunto de cambios fisiológicos que confieren al espermatozoide la habilidad de poder fecundar un ovocito. En estas modificaciones se incluyen cambios bioquímicos y fisiológicos en donde se alteran y eliminan sustancias que fueron integradas a la membrana plasmática del espermatozoide durante su trayecto por el epidídimo (Visconti y Kopf, 1998). Los mecanismos moleculares relacionados a la capacitación espermática incluyen la remoción del colesterol de la membrana plasmática (Cross, 1998) por acción de albúmina y esfingomielinas (Cross, 2000); incremento de calcio intracelular; ingreso de bicarbonato al espacio intracelular; y la acción de segundos mensajeros (Visconti y Kopf, 1998). En ese sentido, durante la capacitación se describe un aumento en la producción de AMPc, desencadenado por la adenil ciclasa e incremento en la fosforilación de proteínas en el residuo tirosina. También es probable que la producción de especies reactivas de oxígeno acelere la fosforilación de proteínas y por lo tanto la capacitación (Herrero et al., 1999; De 12 Lamirande y O´Flaherty, 2008). Algunas especies reactivas de oxígeno como anión superóxido y peróxido de hidrógeno son producidas en pequeñas cantidades durante la capacitación y pueden regular el incremento de AMPc, y protein kinasa A (De Lamirande y O´Flaherty, 2008). Además existe un incremento en el pH intracelular e hiperpolarización de la membrana plasmática del espermatozoide. La heparina también estaría relacionada a la capacitación espermática, mediando el aumento de calcio intracelular, AMPc e incremento del pH (Parrish et al., 1988). Otro compuesto relacionado con la capacitación espermática es la glucosa. En bovinos, la glucosa inhibiría la capacitación, mientras que en otras especies se le atribuye un efecto positivo (Visconti y Kopf, 1998). 2.2.2. Reacción acrosomal Luego de una serie de cambios bioquímicos y funcionales, conocidos como capacitación, los espermatozoides pueden desarrollar la reacción del acrosoma. Las modificaciones en la capacitación son importantes, pues permiten incrementar la fluidez y permeabilidad de la membrana espermática y permiten el flujo de iones que son necesarios para iniciar la reacción acrosomal. La reacción del acrosoma es un evento de exocitosis iniciado fisiológicamente inmediatamente después de la unión del espermatozoide al ovocito. La membrana plasmática se fusiona con la membrana acrosomal externa y en múltiples sitios se producen espacios que permiten la liberación del contenido acrosomal. La enzimas hidrolíticas liberadas son necesarias para disolver la estructura de la zona pelúcida y permitir que el espermatozoide ingrese al espacio perivitelino (Tulsiani et al., 1998). Para entender los mecanismos moleculares de la reacción del acrosoma es necesario revisar la estructura del citoesqueleto de la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa. El citoesqueleto de la membrana plasmática es rico en actina, una proteína característica de las fibras musculares. En los espermatozoides capacitados, esta proteína se presenta en forma de filamentos (F-actina) y ha sido sugerido que provee una base para mantener a la fosfolipasa C unida a la membrana espermática. Asimismo, la F- actin forma una barrera física que evita la fusión entre la membrana plasmática y la 13 membrana acrosomal externa (Spungin et al., 1995). En respuesta al incremento de Ca2+ y pH, la F-actina se depolimeriza a su forma soluble G-actin, la cual se dispersa, permitiendo el acercamiento entre la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa (Spungin et al., 1995). Al mismo tiempo, la fosfolipasa A2 separa ácidos grasos de los fosfolípidos produciendo lisofosfolípidos, los cuales promueven la fusión de membranas. Breitbart y Spungin (1997) usando inhibidores específicos, han demostrado que la actividad de la fosfolipasa C y la depolimerización de la F-actin unida a la membrana son esenciales en la fusión de membranas y por lo tanto en la reacción del acrosoma. 2.3 Evaluación de la función espermática La evaluación de espermatozoides nos permite estimar la fertilidad potencial de cualquier semental en condiciones de laboratorio; sin embargo, no debe confundirse la evaluación del semen con la prueba de fertilidad, ya que la última se cuantifica mediante las tasas de concepción y la producción de descendencia viable. La prueba de fertilidad se constituye en la evaluación real de la capacidad reproductiva de un macho; no obstante, la evaluación de parámetros espermáticos proporciona suficientes elementos para la valoración de la capacidad de un reproductor en función de su calidad seminal (Sorensen, 1991; Illera, 1994). Las formas de evaluación de motilidad, integridad de membrana y vitalidad/integridad acrosomal que se describen a continuación son realizadas por un método subjetivo que incluye necesariamente la observación de células en un microscopio. Sin embargo actualmente existe la citometría de flujo que permite evaluar casi todos los parámetros de función espermática como viabilidad, integridad acrosomal, función mitocondrial e integridad de ADN espermático (Cordelli et al., 2005), así como también capacitación espermática, apoptosis, indicadores de estabilidad de cromatina espermática e indicadores de estrés oxidativo (Hollinshead et al., 2004; Martinez-Pastor et al., 2010) mediante un medio automatizado, eficiente y rápido. 2.3.1. Evaluación de la motilidad espermática 14 La determinación de la motilidad es una de las pruebas más utilizadas en la valoración de la calidad del semen. Una fuerte y progresiva motilidad es un índice importante de la viabilidad de la población espermática. A pesar que la motilidad se puede medir con la ayuda de aparatos, normalmente se hace, de forma subjetiva, mediante el examen microscópico realizado por un técnico experimentado (Sorensen, 1991; Illera, 1994). Las muestras deben ser evaluadas tan pronto como sea posible, considerando la influencia que tienen los cambios de temperatura sobre la motilidad espermática. La técnica consiste en la observación microscópica (400x) de una muestra de semen diluida en una lámina portaobjetos temperada; los espermatozoides aparecen activos con movimiento progresivo y se les puede ver momentáneamente individualizados. Se determina el porcentaje de espermatozoides mótiles sobre el total de espermatozoides visualizados (Arthur et al., 1991; Sorensen, 1991; Ax, 2002). En el caso de camélidos sudamericanos, debido a la característica viscosa del semen, no se aprecia la motilidad masal y la motilidad espermática es estacionaria u ondulante y no progresiva (Bravo et al., 2002). 2.3.2. Evaluación de la integridad funcional de membrana Considerando el daño experimentado por los espermatozoides durante los procesos de criopreservación, principalmente debido a la alteración del metabolismo celular y daños en la membrana espermática, toma mucha importancia la adecuada evaluación de la capacidad fecundante de estas células germinales en función de la integridad de dicha membrana (Watson, 2000; Sánchez et al., 2002). La membrana espermática es una estructura dinámica que participa en el reconocimiento y transporte de moléculas, función que le permite adaptar su metabolismo al medio en que se encuentra. La evaluación de su capacidad funcional constituye información importante considerando que la integridad de la membrana plasmática tiene estrecha relación con una adecuada capacitación y reacción acrosómica y, por tanto, con la fertilidad del espermatozoide (Yanagimachi, 1993). 15 La prueba hipoosmótica o HOS (hypoosmotic swelling test) permite evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides mediante la observación de las alteraciones morfológicas que sufren las células al ser expuestas a condiciones hipotónicas (hinchazón y flexión de la parte distal de la cola espermática). Al ser sometidos al desbalance osmótico que ocasiona el medio hipotónico, los espermatozoides intentan alcanzar el equilibrio dejando ingresar agua al medio intracelular y, como consecuencia, la célula aumenta su volumen ocurriendo los cambios morfológicos antes mencionados (Jeyendran et al., 1984). Es así que se puede diferenciar, mediante el uso de un microscopio, aquellos espermatozoides con membrana funcional de aquellos que no la posean pudiendo finalmente, estimar la proporción de espermatozoides que contaban con una membrana íntegra y operativa. En condiciones fisiológicas la fecundación no ocurre si la membrana plasmática del espermatozoide es disfuncional, aun cuando permanezca estructuralmente intacta, por lo tanto la prueba hipoosmótica es un indicador más preciso que las coloraciones supravitales (Sánchez et al., 2002). 2.3.3. Evaluación de la vitalidad e integridad acrosomal Los espermatozoides vivos no permiten el ingreso de colorantes supravitales, mientras los muertos los absorben; es decir, la membrana espermática representa una barrera al paso de las mencionadas tinciones al medio intracelular. Este fenómeno biofísico permitió el desarrollo de técnicas orientadas a la diferenciación de los espermatozoides vivos de muertos (Sorensen, 1991). Son varios los colorantes que pueden usarse para la determinación de la vitalidad. Éstos, en su mayoría, son mezclas de eosina y algún colorante de contraste, siendo las más usadas las combinaciones Eosina-nigrosina y Eosina- verde resistente (Sorensen, 1991). El acrosoma es un delgado saco membranoso de doble capa que cubre el extremo anterior del núcleo del espermatozoide. Contiene acrosina, hialuronidasa, y otras enzimas hidrolíticas (Garner y Hafez, 2002). La evaluación de este componente espermático resulta esencial al considerar que participa del proceso de fecundación del ovocito. Esta valoración toma mayor relevancia en espermatozoides criopreservados cuya mayor 16 permeabilidad al calcio, inducida por las bajas temperaturas, posibilitan reacciones capacitantes anticipadas que menguarían el potencial fecundante del espermatozoide. En 1989, Didion et al. reportaron una técnica de doble tinción que permite evaluar la vitalidad y la integridad acrosomal de espermatozoides humanos, de manera simultánea. Esta técnica incluye el uso de un colorante vital, el azul tripán, para la diferenciación de espermatozoides vivos y muertos, y al giemsa para la determinación de la integridad del acrosoma. Así mismo, Santiani et al. (2005) hicieron uso de la referida técnica para la evaluación de espermatozoides de alpaca sometidos a congelación encontrando un efectivo método para la evaluación de la vitalidad y la integridad del acrosoma. 2.3.4. Evaluación de la fragmentación de ADN espermático La integridad del ADN espermático puede estar relacionada con el desarrollo embrionario temprano más que con la capacidad fecundante de un espermatozoide (Eid et al., 1994). Existen 4 técnicas utilizadas comúnmente para evaluar la integridad del ADN espermático: prueba Cometa, prueba de estabilidad de la cromatina espermática, el test de naranja de acridina y el TUNEL (Mocé y Graham, 2008). La técnica TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling) consiste en medir las roturas existentes en la cadena de ADN incorporando moléculas marcadas fluorescentemente. Durante la apoptosis o fragmentación del ADN espermático, se producen fragmentos de ADN o cadenas simples de ADN, las cuales son factibles de ser detectados mediante la incorporación de nucleótidos marcados con fluoresceína (Gorzcyca et al., 1993). Los espermatozoides marcados con la sonda del TUNEL presentan una fluorescencia de color verde, que podría ser evaluada mediante microscopia de fluorescencia o mediante citometría de flujo. En el caso de las lecturas mediante microscopia de fluorescencia, se recomienda contar 200 espermatozoides por duplicado para disminuir la probabilidad de error (WHO, 2002), lo cual puede constituir la evaluación en un proceso largo y tedioso. Por el contrario, la evaluación del ensayo de TUNEL mediante citometría de flujo se realiza en segundos y evaluando un población de 10 000 espermatozoides, constituyendo entonces un análisis más objetivo y replicable (Muratori et 17 al., 2008). Existen reportes previos que indican que el porcentaje de daño espermático encontrado mediante citometría de flujo puede ser el doble o hasta el triple que los detectados mediante microscopia del fluorescencia (Muratori et al., 2008). 2.4 Criopreservación de semen Los espermatozoides son células metabólicamente activas que requieren ATP como fuente de energía para permitir el movimiento espermático (Garner y Háfez, 2000). Estas células poseen las enzimas necesarias para realizar diversas reacciones bioquímicas como la glicólisis, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, oxidación de ácidos grasos y transporte de electrones (Garner y Háfez, 2000). La reducción de la temperatura a 4°C reduce la actividad metabólica celular y permite el aumento del periodo de vida de las células. Sin embargo, para detener completamente los procesos metabólicos, los espermatozoides necesitan ser mantenidos a temperaturas inferiores a –130°C (Medeiros et al., 2002). La criopreservación de espermatozoides de mamíferos ofrece muchas ventajas en los sistemas de producción, particularmente en los programas de mejoramiento genético. Sin embargo, el principal obstáculo para la criopreservación de semen es que el proceso de congelamiento-descongelamiento de espermatozoides generalmente tiende a disminuir el porcentaje de células mótiles como resultado del daño celular (Quinn et al., 1969). Consecuentemente, la fertilidad obtenida al utilizar semen congelado es menor en comparación a cuando se utiliza semen fresco (Watson, 2000). Las alteraciones en la estructura y fisiología de la membrana espermática luego del proceso de congelamiento-descongelamiento pueden ser causadas por una combinación de factores como la susceptibilidad de los espermatozoides a la criopreservación y la composición de los medios de dilución de semen (Medeiros et al., 2002). Los efectos adversos causados por el enfriamiento incluyen el daño de la membrana celular y la alteración en la función metabólica de los espermatozoides. Estos efectos adversos pueden ser prevenidos controlando la velocidad de congelamiento y agregando componentes protectores a los diluyentes de semen (Medeiros et al., 2002). 18 2.4.1. Principios de criopreservación El congelamiento de espermatozoides causa estrés a las células como resultado de la interacción agua-solutos, mientras ocurre la formación de cristales de hielo (Holt, 2000). Durante el enfriamiento, la reducción de la temperatura a rangos entre –5 y –10°C produce la formación de cristales de hielo en el medio extracelular en suspensiones celulares. (Medeiros et al., 2002). La presencia de hielo extracelular da lugar a regiones en fase sólida o cristalizada. Por otro lado, estudios de microscopía electrónica muestran que los espermatozoides permanecen excluidos del espacio ocupado por los cristales de hielo (Holt, 2000). Es decir, los espermatozoides permanecen suspendidos en la fracción líquida y gracias a la membrana plasmática se detiene el crecimiento cristalino dentro de la célula. La cristalización en el medio extracelular da lugar a hielo puro, dejando los solutos progresivamente más concentrados en la fracción líquida, a medida que el cambio de fase progresa. Consecuentemente, los espermatozoides en suspensión deben deshidratarse para mantener el equilibrio osmótico con un medio extracelular cada vez más hipertónico, denominado “efecto solución” (Medeiros et al., 2002). La máxima concentración de solutos que puede alcanzarse justo antes de que el agua remanente y los solutos de la fracción líquida se solidifiquen conjuntamente se denomina punto eutéctico. El sobreenfriamiento consiste en un estado metaestable, en el que la suspensión celular enfriada lentamente alcanza temperaturas por debajo de su punto de cristalización manteniéndose sin embargo en estado líquido. En consecuencia, el agua intracelular sobreenfriada, fluye hacia al extracelular en respuesta a la diferencia osmótica que se crea entre el medio intra y extracelular (Medeiros et al., 2002). De esta manera, este proceso produce deshidratación celular. La deshidratación severa causada por el “efecto solución” produce la desnaturalización de macromoléculas y una excesiva reducción del tamaño celular hasta el colapso irreversible de la membrana plasmática (Mazur, 1984). Por otro lado, cuando se utilizan velocidades de congelamiento rápidas, la inadecuada deshidratación de la célula produce la formación de cristales de hielo intracelularmente, los cuales tienen un efecto letal (Mazur, 1984). Consecuentemente, la velocidad de congelamiento debe ser lo suficientemente lenta para permitir que ocurra la deshidratación celular, impidiendo la formación de hielo intracelular, y al mismo tiempo, debe ser lo 19 suficientemente rápida para prevenir la exposición del espermatozoide a condiciones hiperosmóticas crecientes y consecuentemente deshidratación excesiva (Holt, 2000). 2.4.2. Proceso de criopreservación Los protocolos de congelamiento de semen en mamíferos incluyen generalmente 2 pasos: en el primero el semen es diluido y enfriado hasta temperaturas cercanas a 0°C, mientras que en el segundo paso, el semen es congelado y posteriormente almacenado en nitrógeno líquido (Salamon y Maxwell, 2000). El semen diluido es enfriado hasta temperaturas cercanas a 0°C (Salamon y Maxwell, 2000). El periodo de enfriamiento entre 30 a 5°C disminuye la motilidad espermática (Fiser y Fairfull, 1986) y tiene una duración que varía entre a 1 a 3 horas (Kumar et al., 2003). Algunos autores incluyen un periodo de 14 horas a 5°C antes de iniciar el congelamiento para permitir el equilibrio celular (El-Alamy y Foote, 2001). Sin embargo, Salamon y Maxwell (2000) sostienen que el enfriamiento hasta los 5°C en un periodo de 1,5 a 2 horas es suficiente para permitir un adecuado periodo de equilibrio entre los espermatozoides y el medio. Cuando la temperatura del semen llega a 5°C, empieza el proceso de congelamiento, el cual puede ser realizado suspendiendo las pajillas en vapores de nitrógeno líquido (Salamon y Maxwell, 2000) o utilizando equipos congeladores programables (Kumar et al., 2003). La velocidad de congelamiento es de considerable importancia para la viabilidad espermática durante el rango crítico de temperatura (Kumar et al., 2003). Este rango es definido como el periodo donde ocurre la formación de cristales de hielo y la consecuente deshidratación celular (Kumar et al., 2003). En el caso de espermatozoides de ovinos, los principales daños al espermatozoide ocurren entre –10°C a –25°C (Salamon y Maxwell, 1995), tanto al congelar como al descongelar, y no durante el almacenamiento en nitrógeno líquido (Mazur, 1965). En general, el rango crítico de temperatura comprende entre los – 5°C a los –50°C (Kumar et al., 2003). 20 La óptima velocidad de congelamiento permite la mayor sobrevivencia de espermatozoides luego del proceso de congelamiento-descongelamiento. Como se ha mencionado anteriormente, la velocidad óptima de congelamiento es aquella suficientemente lenta para prevenir la formación de hielo intracelular, pero rápida para minimizar los efectos de la exposición prolongada a un medio extracelular hiperosmótico (Holt, 2000). En ovinos la velocidad de congelamiento de 5°C/minuto entre 5 a -25°C; 50°C/minuto entre –25°C a -130°C y posterior inmersión en nitrógeno líquido produce la mejor viabilidad, actividad mitocondrial, integridad del acrosoma y fertilidad in vitro e in vivo (Byrne et al., 2000). Por lo tanto, para ovinos la reducción de la temperatura a 5°C/minuto durante el rango crítico de congelamiento parece ser la más cercana a la velocidad óptima de congelamiento. No obstante, la velocidad óptima de congelamiento varia en otras especies. De esta manera, en espermatozoides humanos es 1-10°C/minuto, debido a que velocidades de congelamiento mayores (25-45°C/ minuto) causan formación de hielo intracelular que daña las membranas plasmáticas (Devireddy et al., 2000). Por otro lado, en espermatozoides bovinos la velocidad óptima de congelamiento es 50- 100°C/minuto (Medeiros et al., 2002). Una vez congelado el semen, la temperatura óptima para sumergir las pajillas en nitrógeno líquido varía entre –125°C a –130°C (Byrne et al., 2000). Mantener las pajillas 8 cm encima de nitrógeno líquido también permite reducir la temperatura dentro de las pajillas a –150°C en 15 minutos (El-Alamy y Foote, 2001). Sumergir las pajillas a mayores temperaturas (entre –25 a –75°C) ó sumergirlas directamente al nitrógeno líquido resulta en una gran disminución de la motilidad y viabilidad espermática (Salamon y Maxwell, 2000). Finalmente, el descongelamiento del semen es tan importante como la fase de congelamiento, debido a que los espermatozoides tienen que atravesar nuevamente el rango crítico de temperatura (Salamon y Maxwell, 2000). El descongelamiento rápido es necesario para prevenir la recristalización de cualquier cristal de hielo intracelular presente en el espermatozoide. En la mayoría de trabajos, la descongelación de pajillas de semen se realiza en baño maría a 37-50°C durante algunos segundos hasta 5 minutos (El-Alamy y Foote, 2001; Kumar et al., 2003). Por otro lado, Salamon y Maxwell (2000) señalan que temperaturas de descongelamiento altas (60-75°C) son similares a temperaturas entre 38- 21 42°C en términos de motilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento. En contraste, el descongelamiento a temperaturas menores de 37°C previene el shock osmótico y mantiene la integridad de membrana en espermatozoides bovinos (Correa et al., 1996), aunque disminuye la motilidad tanto en espermatozoides ovinos (Fiser et al., 1981) como bovinos (Correa et al., 1996). Asimismo, el descenso de la viabilidad espermática es más pronunciado en espermatozoides descongelados en temperatura ambiente, lo cual sugiere un daño causado por revitrificación de cristales de hielo durante el descongelamiento lento (Fiser et al., 1981). 2.4.3. Criopreservación de espermatozoides en alpacas La criopreservación de semen permite el mantenimiento de espermatozoides en temperaturas muy bajas (N2 líquido, -196°C), siendo posible mantener estas células por periodos indefinidos de tiempo. En camélidos sudamericanos, la información relacionada a la criopreservación de semen es escaza y como consecuencia aún no se trabaja en forma masiva en inseminación artificial con semen congelado. Algunas razones por las cuales no se ha desarrollado mas este tema incluyen la dificultad en la colección de semen, la alta viscosidad seminal, la reducida concentración espermática y la gran cantidad de espermatozoides anormales que se encuentran al inicio en la mayoría de muestras, que en conjunto incrementan la dificultad de obtener parámetros espermáticos suficientes que garanticen la fecundación luego del proceso de criopreservación (Bravo et al., 1997). En alpacas sólo existe un trabajo sobre criopreservación de semen de alpaca (Santiani et al., 2005) y unos 4 estudios sobre criopreservación de espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo (Morton et al., 2007, 2010; Rodriguez, 2009; Banda et al., 2010). En llamas, la situación es similar, encontrando los trabajos de Von Baer y Hellemann (1999) y Aller et al. (2003). Adicionalmente encontramos otros trabajos descritos en forma muy superficial en resúmenes de eventos científicos como los reportados por Bravo et al. (1996) y Valdivia et al. (2000) en espermatozoides de alpacas; y Graham et al. (1978) y Bravo et al. (1996) en espermatozoides de llamas. 22 Cuadro 2. Estudios realizados en criopreservación de espermatozoides de camélidos sudamericanos Origen de Motilidad (%) Autores Año Especie Dilutor/crioprotector muestra Fresco Fresco Morton et al. 2010 Alpaca Epidídimo Lactosa -glicerol 2% 52.7 16.1 Lactosa -glicerol 3% 20.5 Lactosa -glicerol 4% 18.5 Biladyl 53.0 14.4 Biladyl-Equex 21.5 Banda et al. 2010 Alpaca Epidídimo Leche 31.0 17.0 Rodriguez 2009 Alpaca Epidídimo Tes-DMA 21.2 13.59 Tes-DMA-P. 16.31 Seminal Morton et al. 2007 Alpaca Epidídimo Citrato 46.9 6.9 Lactosa 18.2 Tris 11.3 González 2008 Alpaca Semen Glicerol-Yema 75.0 15.0 Epidídimo Glicerol-Yema 25.0 5.0 Santiani et al. 2005 Alpaca Semen Leche-etilenglicol 72.0 20.0 Leche-glicerol 15.3 Tris-glicerol 4.0 Tris-etilenglicol 1.0 Aller et al. 2003 Llama Semen Citrato-glicerol 54.3 20.4 Valdivia et al. 1999 Alpaca Semen Glicerol-yema 60-98 15-20 von Baer y H 1999 Llama Semen Tris n.d. 26.8 Tris-equex n.d. 25.0 Bravo et al. 1996 Alpaca Semen Citrato-yema 80.0 30-40 Mc Evoy et al. 1991 Llama Semen Tris-yema-glicerol n.d. 10.0 Graham et al. 1978 Llama Semen No disponible 50.0 45.0 23 En los estudios mencionados anteriormente, el único parámetro seminal evaluado en todos los experimentos es la motilidad espermática. La motilidad espermática post descongelamiento de alpacas varía alrededor del 10-20% (Morton et al., 2007, 2010; Santiani et al., 2005; Valdivia et al., 2000), en forma similar a lo reportado en llamas (Von Baer y Hellemann, 1999; Aller et al., 2003) (Cuadro 2). Aparentemente no existen diferencias en motilidad al trabajar con espermatozoides obtenidos del epidídimo con o sin plasma seminal (Rodriguez, 2009) en comparación con espermatozoides obtenidos de semen (Santiani et al., 2005). Es interesante destacar que según los reportes de Banda et al. (2010) y Rodríguez (2009), si bien la motilidad post descongelamiento varia alrededor del 20%, los porcentajes de viabilidad pueden alcanzar un rango de 40 a 50%. Asimismo, se puede observar que los acrosomas no experimentan un daño importante durante el proceso de criopreservación (Morton et al., 2007, 2010; Santiani et al., 2005). Estos resultados indicarían que las células espermáticas han sido desestabilizadas durante los procesos de congelamiento/descongelamiento, alterando su función de motilidad, pero no causando la muerte celular. 2.4.4. Dilutores y agentes crioprotectores La osmolaridad del diluyente afecta la calidad espermática en mamíferos luego del descongelamiento, obteniéndose la mejor motilidad post descongelamiento en medios con una osmolaridad entre 300 a 360 mOsm/kg (Molinia et al., 1994) ó entre 450 a 750 mOsm/kg (Fiser et al., 1981). La integridad de la membrana plasmática resiste hasta 1000 mOsm/kg en condiciones hiperosmóticas. No obstante, cuando los espermatozoides retornan a condiciones isosmóticas, niveles superiores a 600 mOsm/kg alteran la motilidad y la integridad de membranas (Curry y Watson, 1994). Entonces, el daño a la membrana plasmática ocurre durante el descongelamiento (condiciones osmóticas descendentes), pero es marcado por el estrés hiperosmótico durante el congelamiento. Por lo tanto, los espermatozoides requieren de sustancias que permitan disminuir el efecto del estrés osmótico durante la criopreservación. 24 Los efectos nocivos producidos durante la congelación son disminuidos por los agentes crioprotectores. Los agentes crioprotectores son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad que disminuyen el punto eutéctico de una solución dada (García y Vila, 1984), previniendo de esta forma el estrés osmótico. El descenso del punto eutéctico implica que se alcanzará la máxima concentración de solutos a una temperatura menor, de forma que los espermatozoides estarán más deshidratados y el estrés osmótico al que estarán sometidos será menor (García y Vila, 1984). De esta manera, los agentes crioprotectores previenen la formación de hielo intracelular debido a la mayor deshidratación celular (Medeiros et al., 2002). Los agentes crioprotectores pueden clasificarse en agentes penetrantes ó de acción intracelular y agentes no penetrantes ó de acción extracelular. Agentes crioprotectores penetrantes o permeantes. Son sustancias de bajo peso molecular y por ello pueden ingresar a la célula a través de la membrana plasmática. Estos agentes al ingresar a la célula, evitan los efectos nocivos de la deshidratación excesiva causada por la congelación lenta. Asimismo, los crioprotectores que atraviesan la membrana plasmática reemplazan el volumen de agua que sale al extracelular. Consecuentemente, los crioprotectores también mantienen el volumen celular, evitando el colapso de los espermatozoides por una deshidratación excesiva (Medeiros et al., 2002). Entre los más utilizados están: glicerol, etilenglicol, dimetilsulfóxido y propanediol (Boiso, 2001). Los agentes crioprotectores penetrantes, dependiendo de su concentración, pueden ser tóxicos para los espermatozoides, induciendo alteraciones en la membrana plasmática y disminuyendo la motilidad espermática (Medeiros et al., 2002). En el cuadro 3 se presentan las características biofísicas de los principales crioprotectores penetrantes. 25 Cuadro 3. Características biofísicas de los crioprotectores penetrantes Parámetros Glicerol Etilenglicol Dimetilsulfóxido Fórmula química C3H5(OH)3 (CH2OH)2 (CH3)2SO Peso molecular 92,10 62,07 78,13 Densidad 1,25 1,10 1,11 Masa (g/L) 1 M 92,10 62,07 78,13 Volumen (mL/L) 1 M 73,70 55,90 71,00 Agentes crioprotectores no penetrante o no permeantes. Son sustancias de alto peso molecular que son efectivas cuando se utilizan velocidades altas de congelación. Ejercen su acción crioprotectora por estimulación osmótica de la rápida deshidratación celular, de esta manera disminuyen el volumen de agua intracelular que podría formar cristales de hielo (Medeiros et al., 2002). También aumentan la viscosidad del medio extracelular a bajas temperaturas. Por lo tanto, reducen la formación de cristales de hielo (De Leeuw et al., 1993). Además se ha encontrado que los azúcares interactúan con la membrana plasmática al formar puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de los azúcares con los grupos fosfato de los fosfolípidos de membrana. Al reemplazar el agua alrededor de los fosfolípidos, previenen el daño a la membrana durante la deshidratación celular (De Leeeuw et al., 1993). Estos agentes suelen usarse en asociación con los agentes penetrantes. Los más utilizados son: sacarosa, glucosa, dextrosa, polivinil-pirrolidona (PVP), dextrano, polietilenglicol, entre otros (Boiso, 2001). 26 2.4.5. Efectos de la criopreservación en la función espermática Una de las principales características de los espermatozoides criopreservados es la disminución de la proporción de células mótiles. Mientras la minoría de células muestran motilidad progresiva vigorosa, la mayoría presentan motilidad afectada en diferentes grados. En ese sentido, tanto la motilidad, como la motilidad progresiva son factores importantes para optimizar las tasa de fecundación (Watson, 2000). Generalmente se asume que un 40 a 50% de los espermatozoides no sobreviven al proceso de congelamiento-descongelamiento. Por lo tanto el semen congelado siempre va a ser de menor calidad que el semen fresco (Watson, 2000). Las características del semen fresco de ovinos tienden a disminuir por efecto del proceso de congelamiento- descongelamiento, al igual que en las demás especies. La motilidad inicial del semen fresco en alpacas varía entre 40 a 80% (para descender hasta 10-20% luego del descongelamiento (Morton et al., 2007, 2010; Santiani et al., 2005). En otras especies, se parte de una motilidad inicial superior, encontrando porcentajes de motilidad posdescongelamiento que varían entre 40 a 60%. Así en ovinos la motilidad inicial varía entre 60 a 80% (Garner y Háfez, 2002), mientras que la motilidad post descongelamiento se reduce a valores entre 40 a 60% (Salamon y Maxwell, 2000). A pesar que la proporción de espermatozoides mótiles luego del proceso de congelamiento-descongelamiento es aceptable, sólo un reducido número de los espermatozoides viables se mantiene sin alteraciones biológicas (Salamon y Maxwell, 2000). El proceso de criopreservación está relacionado a la capacitación espermática. En ovinos, los espermatozoides luego del proceso de congelamiento-descongelamiento muestran un alto porcentaje de capacitación en comparación con espermatozoides de semen fresco (Pérez et al., 1996; Maxwell y Watson, 1996). En ese sentido, el porcentaje de espermatozoides capacitados en semen fresco varía entre 5 a 20%, mientras que en espermatozoides descongelados el porcentaje de capacitación puede llegar hasta 90% (Pérez et al., 1996), aunque varía entre 40 a 60% (Gil et al., 2003). Similares resultados son reportados en espermatozoides bovinos (Cormier et al., 1997). Adicionalmente, el proceso de congelación de espermatozoides ovinos induce cambios en la exposición de 27 epítopes de actina en la superficie espermática (De las Heras et al., 1997) que también estarían relacionados a los procesos de capacitación. En camélidos sudamericanos no existen estudios que indiquen si este fenómeno estaría ocurriendo en forma similar. En relación a la integridad acrosomal, la criopreservación aumentaría ligeramente la reacción del acrosoma en espermatozoides viables de alpacas. De acuerdo a los reportado por Morton et al., (2010) y Santiani et al. (2005) la cantidad de daño acrosomal producido por el proceso de criopreservación es menor al 5%. Del mismo modo, en ovinos, la mayoría de espermatozoides que sobreviven el proceso de congelamiento-descongelamiento (40- 70%) mantienen sus acrosomas intactos (Valcárcel et al., 1997). Solamente alrededor del 10% (Pérez et al., 1996; D'Alessandro et al., 2001; Gil et al., 2003) de espermatozoides vivos luego del descongelamiento experimentan reacción acrosomal, en comparación con la reacción acrosomal menor a 4% en semen fresco de ovino (Pérez et al., 1996; Valcárcel et al., 1997; Paulenz et al., 2002). Solamente Maxwell y Watson (1995) reportan porcentajes más elevados de reacción acrosomal, aunque siempre con la menor proporción para semen fresco (19%) en comparación con semen congelado (25-30%). 2.5 Vitrificación de semen La vitrificación es un procedimiento para preservar embriones, ovocitos, espermatozoides y tejidos gonadales en nitrógeno líquido a -196°C (Shaw y Jones, 2003). Una de las principales diferencias con los métodos tradicionales de criopreservación (congelamiento lento) es que se logra un descenso de la temperatura muy rápido (entre 300- 600°C/minuto ; Isachenko et al., 2004a). Esto se logra colocando las muestras celulares directamente en el nitrógeno líquido (Isachenko et al., 2004a) en donde se busca el menor tiempo de equilibrio entre el medio vitrificante y las células (Shaw y Jones, 2003). En este caso no se forman cristales de hielo, sino moléculas parecidas al vidrio, de ahí el nombre de vitrificación (Shaw y Jones, 2003). Otra característica, es que por ser un método muy rápido, de producirse ROS, su efecto nocivo para las células sólo sería durante un máximo de 5 minutos, en comparación con el congelamiento tradicional donde las células pueden estar expuestas a ROS entre 30 a 120 minutos durante el periodo de equilibrio. 28 En el caso de la vitrificación de ovocitos o embriones, se utilizan altas concentraciones (30-50%) de agentes crioprotectores (glicerol, etilenglicol, dimetisulfóxido, etc), cuyos efectos tóxicos son conocidos en espermatozoides (Isachenko et al., 2004b), sin embargo, el método descrito para vitrificar espermatozoides tiene como ventaja que evita la utilización de agentes crioprotectores permeantes (Isachenko et al., 2004b). La vitrificación de espermatozoides viene siendo estudiada en espermatozoides de primates humanos (Isachenko et al., 2004, 2004b, 2008; Hossain y Osuamkpe, 2007) y no humanos (Dong et al., 2009), en espermatozoides de caninos (Sánchez et al., 2011) e incluso en espermatozoides de salmón (Oncorrhynchus mykiss) (Merino et al., 2011a, 2011b). En humanos, Isachenko et al. (2004b) reportan un 50% de motilidad luego de la vitrificación, sin embargo, también se reporta que la vitrificación puede aumentar considerablemente el porcentaje de células apoptóticas (Tahmineh et al., 2007). En espermatozoides de salmón se ha obtenido más de 80% de motilidad y vitalidad, así como un 50% de integridad de membrana mitocondrial utilizando un medio de vitrificación junto con albúmina sérica bovina y plasma seminal (Merino et al., 2011b). En la única especie de mamífero doméstico /perro) donde se han realizado experimentos de vitrificación de espermatozoides, se ha obtenido un 42.5% de motilidad luego de la vitrificación (Sánchez et al., 2011). No existen reportes sobre vitrificación en otros mamíferos domésticos como rumiantes ó camélidos. 2.6 Especies reactivas de oxígeno El término “especies reactivas de oxígeno” ó ROS se refiere a todos los radicales libres o especies activadas de oxígeno que puedan causar daño oxidativo (Fuchs et al., 1997). En las mitocondrias, el oxígeno reacciona con el hidrógeno, en un proceso denominado fosforilación oxidativa. La reacción química consiste en la reducción tetravalente del oxígeno molecular hacia agua (Fridovich, 1998). En una reacción secundaria, los ROS son formados por la reducción univalente del oxígeno (Fuchs et al., 29 1997). Algunos de los radicales libres de oxígeno son: radical peróxido (ROO.), radical hidroxilo (OH.) y anión superóxido (O .- 2 ), mientras que el principal ROS no radical es el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Aitken y Fisher, 1994). Los radicales libres de oxígeno, son moléculas reactivas intermediarias de corto tiempo de vida, que tienen uno o más electrones no apareados girando en sus órbitas externas (Warren et al., 1987). Esta condición químicamente muy inestable, los torna sumamente activos, puesto que el electrón no pareado busca salir de su desequilibrio. Para ello, debe oxidar, es decir, sustraer un electrón a cualquier molécula vecina, alterando su estructura y convirtiéndola a su vez en otro radical libre (Fridovich, 1998). De esta manera pueden iniciar reacciones en cadena, como por ejemplo la peroxidación lipídica (Fuchs et al., 1997). El radical hidroxilo (OH.), es una de las moléculas derivadas del oxígeno más reactivas. Su reactividad es tan grande, que cuando se forma en sistemas biológicos, los radicales reaccionan inmediatamente con cualquier molécula vecina. Por lo tanto, el OH. generalmente no sale de su sitio de generación y actúa causando daño molecular a los ácidos nucléicos o proteínas funcionales (Fuchs et al., 1997). El anión superóxido (O .- 2 ) es un radical libre con reactividad intermedia. Este radical es capaz de difundirse y reaccionar con moléculas específicas. El O .- 2 es formado en las células durante el transporte de electrones en la mitocondria (Baker y Aitken , 2004) y el retículo endoplasmático (Fush et al., 1997). En general, el daño causado por el O .- 2 , es debido a su conversión hacia especies más reactivas. El O .- 2 se dismuta a peróxido de hidrógeno (H2O2) y la subsiguiente descomposición a radicales hidroxilo (OH.) serían los responsables de su efecto biológico (Fuchs et al., 1997). Existen varios métodos para detectar la presencia de anión superóxido como quimioluminiscencia, sin embargo estos métodos no detectan el O .- 2 intracelular, como si lo puede hacer el dihydroethidium (DHE) (Burnaugh et al., 2007). Existen reportes que indican que es posible cuantificar los niveles de O .- 2 en espermatozoides equinos mediante la detección de DHE por citometría de flujo. 30 2.6.1. Estrés oxidativo seminal En los organismos vivos, existe una continua producción de ROS que es controlada por protectores moleculares denominados antioxidantes. El estrés oxidativo es la alteración del balance entre oxidantes y antioxidantes (Fuchs et al., 1997). Este término se aplica cuando los oxidantes superan a los antioxidantes (Sies, 1993), se desarrollan productos de peroxidación (Spitteler, 1993) y cuando estos fenómenos causan efectos patológicos (Janssen et al., 1993). El estrés oxidativo seminal está relacionado con pérdida de la función espermática (Álvarez y Storey, 1989) y por lo tanto con infertilidad (Aitken, 1994). Este estrés está originado por la excesiva producción de ROS por los espermatozoides (Aitken y Clarkson, 1987; Álvarez et al., 1987) o por leucocitos activados presentes en el plasma seminal (Aitken et al., 1994), resultando en la peroxidación de los ácidos grasos insaturados en la membrana espermática (Aitken et al., 1989). Además, los ROS reducen la fusión espermatozoide-ovocito, penetración de espermatozoides a ovocitos (Blondin et al., 1997), afectan la integridad del ADN (Aitken et al., 1998) y motilidad espermática (Álvarez y Storey, 1989; Baumber et al., 2002; Bilodeau et al., 2002). El daño espermático inducido por el estrés oxidativo no sólo depende de la naturaleza y cantidad de ROS, sino también del momento y duración de la exposición a ROS y otros factores extracelulares como temperatura, tensión de oxígeno y la presencia de factores ambientales como iones, proteínas y antioxidantes (Saleh y Agarwal, 2002). 2.6.2. Producción de ROS en el semen En humanos, los niveles de ROS están relacionados negativamente con la calidad seminal (Gómez et al., 1998). Los espermatozoides son células particularmente sensibles a la acción de ROS por su escaso contenido de enzimas antioxidantes, la gran proporción de ácidos grasos poli-insaturados en su membrana plasmática y por la presencia del sistema NADPH oxidasa unido a membrana (Wai-sum et al., 2006). Espermatozoides morfológicamente anormales (Aitken et al., 1987, 1989; Ball y Vo, 2002), con poca motilidad (Aitken y Clarkson, 1988) y la presencia de leucocitos activados han sido 31 relacionados con la producción de elevadas cantidades de ROS (Aitken et al., 1994; Baumber et al., 2002). En ese sentido, espermatozoides equinos morfológicamente anormales producen mayores cantidades de ROS que los espermatozoides normales (Ball et al., 2001). Asimismo, espermatozoides con exceso de citoplasma residual aumentan la producción de ROS, probablemente debido a la presencia de la enzima G6PD, la cual estimula la formación de NADPH (Aitken et al., 1995). Por otro lado, la adición de calcio ionóforo también estimula la producción de ROS en espermatozoides humanos (Aitken et al., 1987) y equinos (Ball, 2001). Además, la producción de ROS aumenta con el tiempo de incubación y concentración de espermatozoides (Ball, 2002). Consecuentemente, la presencia de altos niveles ROS se relaciona a individuos con problemas de fertilidad En ovinos, se ha demostrado la presencia de grandes cantidades de la enzima amino ácido aromática oxidasa, responsable de la producción de peróxido de hidrógeno (Upreti et al., 1998). En humanos, los espermatozoides estarían generando ROS a través de dos mecanismos: (1) el sistema NADPH oxidasa a nivel de la membrana plasmática (Aitken et al., 1992; Sukla et al., 2005)) y (2) el NADH dependiente oxido-reductasa a nivel mitocondrial (Gavella y Lipovac, 1992). Por otro lado, en bovinos, los ROS serían formados vía la desaminación oxidativa de aminoácidos aromáticos. En conejos, se ha propuesto que los ROS derivarían de la cadena de transporte de electrones a nivel mitocondrial (Aitken y Fisher, 1994). Resumiendo, los mecanismos celulares responsables para la generación de ROS por espermatozoides de mamíferos no están demostrados, aunque aparentemente existirían diferencias entre especies. Sin embargo existe consenso en que algunos de los principales radicales producidos por los espermatozoides serían el anión superóxido (Burnaugh et al., 2007) y el peróxido de hidrógeno (Sukla et al., 2005). 2.6.3. Efectos fisiológicos de ROS en espermatozoides Si bien se sabe que los ROS están relacionados con la peroxidación lipídica de la membrana espermática, existen evidencias que el anión superóxido (O .- 2 ) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) también participarían en la inducción de eventos fisiológicos del espermatozoide como capacitación espermática, hiperactivación y reacción acrosomal 32 (Aitken y Fisher, 1994; Baker y Aitken, 2004). Además los ROS también estarían regulando la condensación nuclear, activación de la motilidad espermática, hiperactivación, y la fusión espermatozoide-ovocito (Baker y Aitken, 2004). Capacitación espermática inducida por ROS Existen evidencias que pequeñas cantidades de ROS iniciarían el proceso de capacitación (O'Flaherty et al., 1999; Burnaugh et al., 2007, De Lamirande et al., 2009), debido a que los espermatozoides capacitados producen más ROS que los espermatozoides no capacitados (De Lamirande et al., 1998). Asimismo, la capacitación espermática puede ser inducida prematuramente por la presencia de ROS exógeno (De Lamirande y Gagnon, 1993; Villegas et al., 2003). En ese sentido, la presencia del anión superóxido (O .- 2 ) es necesaria para la capacitación espermática de espermatozoides bovinos (O'Flaherty et al., 1997) y equinos (Burnaugh et al., 2007) e incluso puede reemplazar a la heparina como inductor de la capacitación (O'Flaherty et al., 1999). Durante el proceso de capacitación, RPS incrementan la fosforilazión de proteínas tirosina y AMPc (Ford, 2004). Por otro lado, la capacitación espermática puede ser bloqueada mediante la adición de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa en espermatozoides humanos (De Lamirande y Gagnon, 1993, De Lamirande et al., 2009) y bovinos (O'Flaherty et al., 1997, 1999). Estos resultados sugieren que el anión superóxido (O .- 2 ) promueve la capacitación espermática (O'Flaherty et al., 1999, 2003, Burnaugh et al., 2007). El rol del peróxido de hidrógeno (H2O2) no está bien definido en el proceso de capacitación. A pesar que el H2O2 aumenta significativamente durante la capacitación espermática (O'Flaherty et al., 2003), la adición de catalasa no modifica el porcentaje de espermatozoides capacitados (O'Flaherty et al., 1999). Por el contrario, la adición de H2O2 al medio capacitante disminuye la capacitación en espermatozoides bovinos descongelados (O'Flaherty et al., 1997). Dichos autores sugieren que el H2O2 generado por dismutación del O .- 2 , no participaría en la capacitación de espermatozoides bovinos. No obstante, en espermatozoides de hámsters, el peróxido de hidrógeno (H2O2) juega un rol importante en la capacitación espermática (Bize et al., 1991). 33 El radical libre óxido nítrico (NO) también parece estar relacionado con la capacitación espermática. En ese sentido, la incubación de espermatozoides humanos en NO acelera la capacitación espermática y la capacidad a responder a inductores de la reacción acrosomal (Herrero et al., 1999). Por otro lado, la adición de inhibidores del NO provoca una disminución significativa en la respuesta espermática a la inducción de la reacción acrosomal por fluido folicular humano ó calcio ionóforo (Herrero et al., 1999). El mecanismo por el cual el óxido nítrico estaría acelerando la capacitación espermática parece estar relacionado a un incremento en la fosforilación de proteínas en tirosina (Herrero et al., 1999). Estos resultados sugieren que la producción de óxido nítrico es necesaria para la capacitación de espermatozoides humanos y para permitir la respuesta a inductores de la reacción acrosomal. Reacción acrosomal inducida por ROS La presencia de ROS está relacionada a la reacción acrosomal. Esto se infiere a partir del estudio de Bize et al. (1991) quienes señalaron que la adición de catalasa al medio capacitante, inhibe la reacción acrosomal en espermatozoides de hámsters, mientras que la adición de H2O2 ó glucosa oxidasa (enzima que genera H2O2) acelera el inicio de la reacción acrosomal. Del mismo modo, la adición de superóxido dismutasa en conjunto con catalasa en espermatozoides capacitados reducen la reacción acrosomal inducida por lisofosfatidilcolina o bloquean la reacción acrosomal inducida con calcio ionóforo (De Lamirande et al., 1998). Además, la incubación de espermatozoides con el sistema xantina y xantina-oxidasa (De Jonge et al., 1991; De Lamirande et al., 1998) ó inhibidores de la xantina fosfodiesterasa, aumentan la reacción acrosomal (De Jonge et al., 1991). De igual manera, la presencia de ROS está relacionada con la reacción acrosomal y capacidad de espermatozoides de rata de unirse y penetrar ovocitos libres de zona pelúcida (Hsu et al., 1999). El mecanismo por el cual los ROS estimulan la reacción acrosomal puede relacionarse al aumento de la fosforilación en tirosina de las proteínas espermáticas (De Lamirande et al., 1998). En ese sentido, la exposición de espermatozoides humanos a ROS 34 a través de la adición de H2O2 ó de NADPH incrementa la fosforilación de proteínas y la reacción acrosomal (Aitken et al., 1999). Estos resultados confirman el efecto de ROS en la reacción acrosomal de espermatozoides de mamíferos. Además, la hiperactivación espermática, evento que permite que el espermatozoide encuentre al ovocito previo a la reacción acrosomal, también es inducida por ROS (De Lamirande y Gagnon, 1993). Similares resultados son reportados en espermatozoides de hámsters (Bize et al., 1991). Aparentemente, el anión superóxido (O .- 2 ) activa la NADPH oxidasa de la membrana espermática permitiendo de esta manera la hiperactivación (De Lamirande y Gagnon, 1993). 2.6.4. Efectos patológicos de ROS en espermatozoides Los principales efectos nocivos de ROS en espermatozoides incluyen la disminución de la motilidad, incremento de la peroxidación lípidica en la membrana plasmática e incremento en la fragmentación del ADN espermático. Otros parámetros de función espermática no son alterados significativamente en espermatozoides expuestos a niveles altos de ROS (Kasimanickam et al., 2006), ni están relacionados con fragmentación del ADN espermático (Lukanov et al., 2008). Se ha demostrado que el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) está relacionado con una disminución de la motilidad espermática y que la pérdida de motilidad es el indicador más sensible de estrés oxidativo en comparación con otros parámetros seminales (Peris et al., 2007). En un estudio, Stefanov et al. (2004) incubaron espermatozoides de ovino a 39°C por 3 horas, encontrando un incremento entre 8 a 10 veces de anión superóxido y peróxido de hidrógeno, así como una disminución de la motilidad espermática de 80% al incio del experimento hasta 30% luego de 180 minutos. Al adicionar un compuesto biológico que neutraliza los radicales de oxígeno mencionados, la motilidad espermática se mantuvo muy similar a sus valores iniciales (Stefanov et al., 2004). En forma similar, Peris et al. (2007) reportan que la motilidad espermática es el primer parámetro afectado cuando se incuban espermatozoides de ovino con H2O2, mientras que la viabilidad espermática no se altera. Además la reacción acrosomal 35 espontánea no aumenta debido a que la peroxidación lipídica altera los mecanismos de control a nivel de membranas que permiten llevar a cabo la reacción acrosomal (Peris et al., 2007). Estos resultados nos permiten concluir que la motilidad espermática es uno de los principales parámetros de función espermática alterados por ROS. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) también tienen la capacidad de iniciar la cascada de la peroxidación lipídica en la membrana espermática. La peroxidación de los lípidos de la membrana se correlaciona con disminución de la motilidad espermática (Jones y Mann, 1977; Jones et al., 1979; Storey, 1997). También inhibe la actividad fructolítica y respiratoria del espermatozoide (Jones y Mann, 1977). Del mismo modo, altas concentraciones de peróxido de hidrógeno inducen lipoperoxidación y causan muerte celular (Aitken, 1994). La peroxidación lipídica es el deterioro oxidativo de los ácidos graso poli- insaturados (Saleh y Agarwal, 2002). Los ácidos grasos poli-insaturados son susceptibles a experimentar ataque oxidativo porque la presencia de enlaces dobles debilita la unión C-H en los átomos de carbono adyacentes y facilita la sustracción de hidrógeno (Figura 1), paso inicial para el proceso oxidativo (Aitken y Fisher, 1994). Las membranas plasmáticas de los espermatozoides de mamíferos (humanos, Jones et al., 1979, Aitken y De Luliis, 2010); porcinos, Cerolini et al., 2001; equinos, Ball y Vo, 2002) tienen un alto contenido de ácidos grasos insaturados para conferir a su estructura la fluidez necesaria para permitir la fusión de membranas (Aitken y Fisher, 1994). En espermatozoides humanos por ejemplo, existe el 50% de los ácidos graosos de membrana lo representa el ácido docosahexaenoico, que presenta 6 dobles enlaces (Aitken y De Luiis, 2010). Consecuentemente, los espermatozoides son susceptibles a sufrir peroxidación lipídica por ROS (Álvarez y Storey, 1989; Aitken y De Luiis, 2010). 36 Ácido Graso R - CH = CH - CH2 - CH = CH - R' OH. OOH. Sustracción de hidrógeno ó H2O H2O2 Radical lipídico R - CH = CH - .CH - CH = CH - R' Figura 1. Inicio de peroxidación lipídica en relación a la sustracción de un átomo de hidrógeno de un ácido graso poli-insaturado La cascada de la peroxidación lipídica se inicia directamente por la presencia del radical hidroxilo (OH.). El anión superóxido (O .- 2 ) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), no son lo suficientemente reactivos para iniciar la peroxidación lipídica, pero en la presencia de metales de transición, como Fe o Cu, reaccionan (reacción de Haver-Weiss) y forman los radicales hidroxilo (OH.). Los radicales hidroxilo (OH.) también pueden ser formados directamente mediante la reacción de Fenton, a partir del H2O2 en presencia de agentes reductores como Fe2+ (Aitken y Fisher, 1994). En humanos y ratones, la peroxidación lipídica es estimulada por la presencia de H2O2 (Álvarez y Storey, 1989). Sin embargo, en espermatozoides de conejo, el peróxido de hidrógeno no inicia la peroxidación lipídica. Es probable que en algunas especies como el conejo, los radicales hidroxilo (OH.) se formen directamente a partir de la protonación del anión superóxido (O .- 2 ) para generar el radical hidroperoxilo (Aitken y Fisher, 1994), constituyendo una vía alterna para el inicio de la peroxidación lipídica Cuando el radical hidroxilo (OH.) ó el radical hidroperoxilo (HO . 2 ) sustraen un átomo de hidrógeno de un ácido graso poli-insaturado de la membrana plasmática, se forma un radical lipídico (R.). Luego, los radicales lipídicos se combinan con oxígeno para formar el radical lipídico peroxilo (ROO.). Dicho radical propaga la cascada de la peroxidación lipídica al sustraer un átomo de hidrógeno de un ácido graso adyacente, para estabilizarse como peróxido lipídico (ROOH). Por lo tanto, la peroxidación lipídica propaga el daño a través de la membrana espermática en función de oxígeno disponible para la continua 37 generación de radicales peroxilo (Fuchs et al., 1997). En la figura 2 (Aitken y Fisher, 1994) se esquematiza el mecanismo de peroxidación lipídica en espermatozoides. Los peróxidos lipídicos pueden actuar como radicales libres en la presencia de metales de transición. La adición de Fe acelera la aparición del malondialdehido, producto terminal de la cascada de lipoperoxidación (Jones et al., 1979). De este modo, en la presencia de iones Fe, los radicales peroxilo (ROO.) son generados a partir de ROOH, culminando en el aumento de la producción del producto terminal malondialdehido (Fuchs et al., 1997). En ese sentido, el grado peroxidativo en espermatozoides puede ser calculado por el método del ácido tiobarbitúrico (TBA), el cual reacciona con el malondialdehido. De esta manera, la cantidad de malondialdehido generado luego de la incubación de espermatozoides con un promotor del ión ferroso va a depender de la cantidad de peróxidos lipídicos que se hayan acumulado en la célula antes del ensayo (Aitken et al., 1989). Otra de las consecuencias más importantes de los ROS en espermatozoides, es el daño en la integridad del ADN (Baker y Aitken, 2004). En humanos, existe una alta relación entre pacientes infértiles y fragmentación del ADN espermático (Lukanov et al., 2004). Asimismo, estudios clínicos muestran una correlación negativa entre la tasa de clivaje y el daño al ADN (Aitken, 2004). También se ha reportado que los ROS producidos durante la criopreservación aumentan la fragmentación del ADN en ovinos (Peris et al., 2007) y caninos (Sue-Hee et al., 2010). Otros estudios parecen indicar que un espermatozoide con daño en su ADN es capaz de fecundar ovocitos, sin embargo puede estar relacionado con pérdidas embrionarias tempranas, disminución de la tasa de implantación y alta incidencia de anormalidad estructurales en embriones implantados (Wai-sum et al., 2006). El daño al ADN espermático se debe a que los ROS sustraen átomo de H de las unidades ribosa del ADN, formando bases de ADN abducidas. Esto trae como consecuencia la desestabilización de la cadena de ADN y la formación de múltiples fragmentos (Aitken y De Luiis, 2010). Una vez que se ha establecido el daño en el ADN, los espermatozoides inician un proceso de muerte celular similar a la apoptosis, diferenciándose en que los espermatozoides son células transcripcionalmente inertes, que la cantidad de nucleosomas es reducida y que la configuración del ADN espermático previene la acción de nucleasas (Aitken y De Luiis, 2010). 38 SOD .- H2O 2 O 2 Reacción de Fenton Protonación Radical hidroxilo Radical hidroperoxilo Inicio de peroxidación lipídica ROOH Peróxidos lipídicos Peróxidos lipídicos estables en la membrana espermática Metales de transición Propagación de la peroxidación lipídica Ácido Calor Promotores Malondialdehido Ensayo TBA Figura 2. Representación esquemática de las vías de peroxidación lipídica. 2.6.5. Producción de ROS durante criopreservación La producción de ROS aumenta durante el proceso de criopreservación. En ese sentido, la gradual reducción de temperatura estimula la generación del anión superóxido (O .- 2 ) en espermatozoides bovinos. Asimismo, existe un aumento en los niveles de óxido nítrico durante el descongelamiento de espermatozoides bovinos (Chatterjee y Gagnon, 2001) y caninos (Tselkas et al., 2000). Del mismo modo, en espermatozoides caninos (Sue- Hee et al., 2010) y porcinos (Sue-Hee et al., 2011), los niveles de peróxido de hidrógeno intracelular se encuentran aumentados luego del proceso de criopreservación. En humanos, 39 la producción de ROS aumenta significativamente durante el proceso de enfriamiento, con los máximos niveles observados a los 4°C (Wang et al., 1997; Saleh y Agarwal, 2002). Similares resultados han sido encontrado en espermatozoides de ovino (Santiani, 2003). La peroxidación lipídica aumenta en espermatozoides equinos cuando son incubados a 5°C (Ball y Vo, 2002). Sin embargo, los niveles de ROS son extremadamente bajos en espermatozoides incubados a temperaturas inferiores a cero y en espermatozoides descongelados (Wang et al., 1997). Debido a que la formación de ROS es parte de la actividad metabólica de las células, es probable que los ROS disminuyan por efecto de la congelación ya que la viabilidad disminuye. Además, la disminución de la actividad enzimática en temperaturas muy reducidas también explicaría los bajos niveles de ROS observados en espermatozoides congelados y descongelados. La producción de ROS por espermatozoides descongelados no está bien estudiada. En ese sentido, Wang et al. (1997) indican que espermatozoides humanos descongelados pierden la capacidad para producir ROS. Dichos autores incubaron espermatozoides descongelados con polimorfos nucleares por 180 minutos sin conseguir un incremento en la producción de ROS. No obstante, Ball et al. (2001) señalan que la adición de NADPH aumenta significativamente la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) en espermatozoides equinos descongelados en comparación con espermatozoides de semen fresco. Por otro lado, Santiani (2003), reporta que en espermatozoides descongelados de ovino encuentra niveles similares de ROS a los del semen fresco. Elevados niveles de peroxidación lipídica han sido observados luego del proceso de congelamiento-descongelamiento en espermatozoides bovinos (Chatterjee y Gagnon., 2001), ovinos (Santiani, 2003) y humanos (Álvarez y Storey, 1992). El patrón de peroxidación lipídica observada en espermatozoides humanos luego del descongelamiento ha sido relacionado con disminución del contenido de fosfolípidos, especialmente de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolima (Álvarez y Storey, 1992). La disminución de la actividad de la superóxido dismutasa sugiere un efecto del anión superóxido (O .- 2 ) en la peroxidación lipídica durante la criopreservación (Álvarez y Storey, 1992; Lasso et al., 1994). Es probable que la peroxidación lipídica observada luego del descongelamiento haya sido causada durante el proceso de enfriamiento, particularmente en temperaturas cercanas 40 a los 4°C, en donde se producen las mayores cantidades de ROS (Wang et al., 1997; Saleh y Agarwal, 2002). La producción de niveles elevados ROS durante la criopreservación está relacionada con la presencia de ROS en semen fresco. En ese sentido, las muestras de semen con presencia de ROS previo a la criopreservación tienen una alta probabilidad de tener niveles significativamente elevados de ROS luego del proceso de criopreservación (Mazzilli et al., 1995; Tselkas et al., 2000). Por otro lado, en muestras de semen sin presencia de ROS previo al proceso de criopreservación también puede observarse un aumento de ROS, aunque con menor frecuencia (Mazzilli et al., 1995) o con niveles no muy elevados (Tselkas et al., 2000). La producción de ROS durante el proceso de criopreservación está relacionada con pérdida de la función espermática. Los espermatozoides descongelados por lo general presentan disminución de motilidad (Bell et al., 1993; Wang et al., 1997; Tselkas et al., 2000), vitalidad (Wang et al., 1997), alteración en la integridad de la membrana plasmática (Wang et al., 1997; Tselkas et al., 2000) y daño en la estructura del ADN espermático (Baumber et al., 2003). Consecuentemente, la prevención de la producción de ROS durante el proceso de criopreservación es importante para mantener una buena calidad espermática luego del proceso de congelamiento-descongelamiento. 2.7 Antioxidantes Un antioxidante es cualquier sustancia que cuando está presente en bajas concentraciones en comparación con un sustrato oxidable, reduce o inhibe significativamente la oxidación de dicho sustrato (Halliwell, 1995). Los antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar e interactuar más rápido con las especies reactivas de oxígeno en un determinado microambiente (Cuadro 4). La acción de los antioxidantes es de sacrificio de su propia integridad molecular para evitar alteraciones de otras moléculas (Venereo, 2002). Intracelularmente, los principales mecanismos antioxidantes son las enzimas catalasa, glutation peroxidasa y superóxido dismutasa, sin embargo, el espacio disponible para estas enzimas en bastante limitado en 41 los espermatozoides. Además de las enzimas, existen moléculas presentes en el plasma seminal como la transferrina, lactoferrina, ceruloplasmina y albúmina, las cuales se unen a metales de transición de tal forma que éstos no estimulen las reacciones de los radicales libres. Otro grupo de antioxidantes lo constituyen el ácido ascórbico y ácido úrico, los cuales rompen las cadenas de oxidación al eliminar radicales peroxilo (Ochsendorf et al., 1997). Los antioxidantes exógenos actúan como moléculas suicidas, ya que se oxidan al neutralizar al radical libre (Venereo, 2002). Cuadro 4. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acción Intracelular Membrana Extracelular Superóxido dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina Catalasa Betacarotenos Transferrinas Peroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferrinas DT-deafarasa Albúminas Glutation reducido Haptoglobinas Proteínas ligadoras de metales Vitamina C Sistemas proteolíticos Ácido úrico Vitamina C Vitamina E Venereo, G.J (2002) Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes. 2.7.1. Antioxidantes presente en espermatozoides y plasma seminal Los espermatozoides son células que pierden la mayoría de su contenido citoplasmático en forma de gotas citoplasmáticas durante su maduración en el epidídimo, permitiendo un descenso considerable en la cantidad de antioxidantes endógenos y por lo tanto volviéndose dependiente de antioxidantes extracelulares que le permitan superar el estrés oxidativo (Wai-sum et al., 2006). Se ha demostrado que las glándulas sexuales 42 accesorias del macho son la principal fuente de antioxidantes en el eyaculado, proporcionando enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa y glutation peroxidasa, así como vitamina C, vitamina E, hipotaurina, ácido úrico y albúmina (Wai- sum et al., 2006, Ball, 2008). Superóxido dismutasa (SOD) La primera defensa contra el daño causado por el anión superóxido (O .- 2 ) es la superóxido dismutasa (SOD) (Fridovich, 1998). La SOD reacciona específicamente con el anión superóxido mediante la siguiente reacción (Fridovich, 1997): .- .- + O2 + O2 + 2H H2O2 La SOD presente en espermatozoides o plasma seminal de diferentes especies corresponde a la formada por enzimas metaloides Cu-SOD y Zn-SOD, presentes en células eucariotas. Este grupo de SOD contiene cobre y zinc en su sitio activo y se encuentra en el citosol y en el espacio intermembranoso mitocondrial (Venereo, 2002). En espermatozoides no se encuentra la forma manganeso (Mn-SOD). La presencia de la CuZn-SOD en el epitelio germinal de los túbulos seminíferos, espermatozoides y plasma seminal ha sido demostrada en diferentes especies como humanos, ovinos, bovinos, porcinos, equinos, ratones y conejos (Ochsendort et al., 1997). Catalasa La catalasa es la enzima que dismuta el peróxido de hidrógeno (H2O2) de acuerdo a la siguiente reacción (Fridovich, 1998): 2 (H2O2) 2 H2O + O2 La catalasa de mamíferos también puede actuar como peroxidasa a través de pequeñas moléculas como metanol, etanol y nitritos (Fridovich, 1998). Las catalasas 43 forman parte del sistema antioxidante Catalasa/SOD que actúa en presencia de altas concentraciones de H2O2 (Venereo, 2002). En espermatozoides de ovino, conejo y humano se ha demostrado la presencia de catalasa (Ochsendorf et al., 1997). También existe presencia de catalasa en el plasma seminal de equino (Ball et al., 2000). A pesar que en espermatozoides bovinos no se ha observado la presencia de catalasa (Bilodeau et al., 2000), la adición de pequeñas cantidades de esta enzima junto a piruvato mejora la calidad seminal (Bilodeau et al., 2002). Existiendo evidencias que el H2O2 causa daño peroxidativo en espermatozoides (Aitken, 1994), la catalasa debe tener un rol antioxidante en estas células. Glutation y glutation peroxidasa La glutation peroxidasa (GPx) es una enzima selenio dependiente que reduce al peróxido de hidrógeno (H2O2) e hidroperóxidos lipídicos (ROOH) a través de la oxidación de dos moléculas de glutation reducido (GSH) (Álvarez y Storey, 1989). La glutation peroxidasa entonces requiere de GSH para reducir los peróxidos. La reducción del glutation oxidado (GSSG) a GSH se realiza por efecto de la glutation reductasa (Grx). Esta enzima (Grx) necesita la presencia de NADPH para reducir al GSSG. El NADPH se forma por la acción de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) en el NADP+ (Ochsendorf, 1997; Storey et al., 1998). El ciclo del glutation se presenta en la figura 3. De este modo, el glutation desempeña un rol significativo en la defensa antioxidante de las líneas germinales de los túbulos seminíferos, epidídimo y probablemente en los espermatozoides (Irvine, 1996). La actividad de la glutation peroxidasa ha sido demostrada en semen de ovinos, caninos, caprinos y humanos (Ochsendorf et al., 1997). Por otro lado, niveles reducidos de glutation intracelular han sido relacionados con infertilidad en humanos (Ochsendorf et al., 1998). En otras especies como bovinos, existen niveles reducidos de glutation peroxidasa (Bilodeau et al., 2000). 44 H2O2 2 H2O Glutation peroxidasa GPx ROH+H2O ROOH 2GSH GSSG NADP+ NADPH Grx G6PDH NADP+ Figura 3. Ciclo redox del glutation Antioxidantes no enzimáticos La vitamina E ó tocoferol es el principal antioxidante liposoluble. El tocoferol reacciona directamente con ROS en las membranas plasmáticas e inhiben la lipoperoxidación capturando los radicales lipoperoxilo (Ochsendorf et al., 1997). La vitamina C ó ácido ascórbico reacciona directamente con el radical peroxilo y el anión superóxido. Lewis et al. (1997) mencionan que el ácido ascórbico es el antioxidante presente en mayores cantidades en el plasma seminal humano. El ácido ascórbico también actúa en forma sinérgica con el tocoferol para la reducción de los radicales lipoperoxilo, al reaccionar con radicales tocoperoxilos y regenerar tocoferol activo (Ochsendorf et al., 1997). Otros antioxidantes presentes en el plasma seminal son ácido úrico, selenio, transferrinas, ceruloplasminas, zinc, taurina e hipotaurina (Ochsendorf et al., 1997). 2.7.2. Análogos de superóxido dismutasa La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima que tiene la capacidad de dismutar el anión superóxido (Fridovich, 1997). El O .- 2 interacciona con los ácidos grasos insaturados de la membrana espermática, produciendo peroxidación y finalizando en una destrucción 45 generalizada de la membrana (Álvarez y Storey, 1989). En consecuencia, la SOD estaría protegiendo a las células de la toxicidad del ión O .- 2 (McCord y Fridovich, 1969). Sin embargo, la SOD tiene un corto tiempo de vida y debido a su alto peso molecular no es capaz de penetrar las membranas celulares fácilmente. Por lo tanto, se están estudiando compuestos con actividad similar a la SOD que tengan bajo peso molecular y sean biológicamente estables (Luo, 2001, Wilcox, 2010). En ese sentido, Mitchell et al. (1990) identificaron un conjunto de radicales nitróxido estables que poseen actividad similar a SOD, con la ventaja de tener bajo peso molecular, mayor permeabilidad de membrana y ser independiente de metales. Estos análogos de SOD, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), protegen a las células del daño inducido por hipoxantina/xantina oxidasa y peróxido de hidrógeno, a pesar que no exhiben actividad catalasa (Mitchell et al., 1990). Además, los nitróxidos protegen varios sistemas biológicos del estrés oxidativo, incluyendo isquemia, hiperoxia, trauma mecánico, xenobióticos tóxicos, radiación ionizante, irritantes gástricos u oxidantes fuertes (Offer et al., 1998). Es asi, que en los últimos años se ha utilizado Tempol en casos de diabetes mellitus porque mejora la eficiencia de la insulina, reduce la pérdida de peso y previene falla cardiaca (Wilcox, 2010). As{i también protege varios órganos como el corazón y cerebro de daños isquémicos; previene insuficiencia renal por glomerulopatías, protege a las células de distintios tipos de radiación, entre otros (Wilcox, 2010). Incluso, en forma general, cuando es suministrado desde el nacimiento, puede prolongar la esperanza de vida en ratones (Wilcox, 2010). Se ha demostrado que la adición de Tempol 1 mM al medio de cultivo no altera la embriogénesis y más bien previene la formación de malformaciones embrionarias en medios hiperglicémicos (Ruy et al., 2007). Incluso, la adición de Tempol previene en ratones gestantes efectos como proteinuria, hipertensión, producción de ROS en placenta y alteraciones de crecimiento, los cuales son utilizados como modelo de estudio de la preclampsia humana (Hoffmann et al., 2008). Los nitróxidos inhiben el daño oxidativo al dismutar tanto el O .- 2 extracelular como intracelular y convirtiéndolo en H2O2 (Wilcox, 2010) . Adicionalmente, Offer et al. (1998) indican que el efecto protectivo de los nitróxidos no aumenta con el aumento de su 46 concentración (0,5 mM); la combinación de SOD y nitróxidos no provee más protección que la demostrada por SOD o nitróxidos en forma separada; se observa efecto aditivo de nitróxidos con catalasa; y que los nitróxidos no son consumidos durante la reacción, sino reciclados. Por lo tanto, el Tempo y Tempol actúan como antioxidantes principalmente al reaccionar con el anión superóxido, mientras que no confieren protección cuando el daño oxidativo es inducido directamente por peróxido de hidrógeno (Offer et al., 1998). Además, el mecanismo antioxidante de los nitróxidos incluye otras vías como la destoxificación de especies ferryl-heme, facilitando la remoción del peróxido de hidrógeno, capturando y reaccionando con radicales alcohoxil, peroxil y radicales lipídicos, oxidando semiquinonas y terminando reacciones en cadena de radicales (Offer et al., 1998; Luo, 2001). Asimismo, pueden actuar como antioxidantes al oxidar Fe y Cu, previniendo de esta forma la producción de radicales hidroxilo a partir de la reacción de Fenton (Luo, 2001). En resumen, el Tempo y Tempol pueden ser oxidados por ROS como el anión superóxido o radicales hidroxilos, resultando en la forma original de los radicales nitróxidos. Estos a su vez, pueden ser reducidos por diversas sustancias presentes en los sistemas biológicos (Kishioka et al., 2002) de la siguiente manera: . N-OH + (estímulo oxidativo) N-O (radical nitróxido) . N-O + (reductantes in vivo) N-OH 2.7.3. Efecto de antioxidantes en la función espermática La deficiencia de antioxidantes en el plasma seminal está relacionada a infertilidad. En humanos, el ácido ascórbico ó ascorbato es el antioxidante encontrado en mayores cantidades en el plasma seminal. En ese sentido, el plasma seminal de pacientes infértiles astenozooespérmicos tiene menores niveles de ascorbato (Lewis et al., 1997) y de antioxidantes totales (Lewis et al., 1995) que el plasma seminal de hombres fértiles. Del mismo modo, los niveles intracelulares de glutation en espermatozoides están disminuidos 47 en ciertas poblaciones de individuos infértiles. Asimismo, existe asociación entre la concentración de glutation en el plasma seminal humano y la capacidad para penetrar moco cervical bovino (Ochsendorf et al., 1998). Aparentemente, el glutation y la catalasa protegerían a los espermatozoides del efecto de ROS en la fragmentación de ADN (Baumber et al., 2003). Por otro lado, los bajos niveles de SOD están relacionados con aumento de malondialdehido en pacientes infértiles (Sanocka et al., 1996). Consecuentemente, los antioxidantes presentes en el plasma seminal desempeñan un papel importante en la función espermática. Efecto de antioxidantes en la motilidad espermática La adición de antioxidantes mejora la función espermática en espermatozoides de varias especies. En ese sentido, la vitamina E ó tocoferol puede revertir la peroxidación lipídica en espermatozoides humanos (Aitken et al., 1989) o prevenir el daño peroxidativo causado por espermatozoides durante la centrifugación (Aitken y Clarkson, 1988). Igualmente, la adición de taurina, hipotaurina y albúmina sérica bovina inhiben la pérdida de motilidad y reducen la peroxidación lipídica en espermatozoides epididimarios de conejo (Álvarez y Storey, 1983). También, la adición de catalasa mejora la motilidad en espermatozoides bovinos (Bilodeau et al., 2002). La pérdida de motilidad producida por leucocitos activados en espermatozoides humanos también puede ser reducida por la adición en conjunto de glutation, n- acetilcisteina, hipotaurina y catalasa (Baker et al., 1996). Del mismo modo, la adición de glutation oxidado, glutation reducido, dithiothreitol y superóxido dismutasa prolongan la motilidad de espermatozoides bovinos descongelados e incubados a 38°C (Lindemann et al., 1988; Bilodeau et al., 2001; Chatterjee et al., 2001). Debido a que la peroxidación de los lípidos de la membrana se correlaciona con disminución de la motilidad espermática (Jones et al., 1979; Storey, 1997), es probable que la acción de estas moléculas antioxidantes esté relacionada con una disminución en la peroxidación lipídica de los espermatozoides. 48 Sin embargo, existen algunos reportes que indican un efecto negativo o ausencia de efecto de ciertos antioxidantes en la motilidad espermática. En ese sentido, el alfa tocoferol inhibe la motilidad espermática en espermatozoides ovinos, mientras no se observa ningún efecto al adicionar catalasa (Upreti et al., 1997). De igual manera, la adición de hidroxitolueno butilado (BHT) tampoco tiene efecto en la motilidad de espermatozoides humanos (Aitken y Clarkson, 1988). Efecto de antioxidantes en la capacitación espermática y reacción acrosomal La adición de ciertos antioxidantes puede prevenir la capacitación espermática y reacción acrosomal. En ese sentido, la fosforilación de proteínas en residuo tirosina, la cual está relacionada a los procesos de capacitación espermática y reacción acrosomal (Naz, 1996), puede ser inhibida por la adición de catalasa (Aitken et al., 1995). Adicionalmente, la adición de catalasa inhibe la reacción acrosomal inducida por peróxido de hidrógeno en espermatozoides de hámsters (Bize et al., 1991). Sin embargo, la adición de catalasa no inhibe la capacitación en espermatozoides bovinos descongelados (O'Flaherty et al., 2003). Existen evidencias que la superóxido dismutasa inhibe la capacitación en espermatozoides humanos (De Lamirande y Gagnon, 1993) y en espermatozoides descongelados de bovino (O'Flaherty et al., 1997; 1999; 2003). Además, la superóxido dismutasa inhibe la inducción de hiperactivación en espermatozoides humanos (De Lamirande y Gagnon, 1993). Asimismo, la superóxido dismutasa y catalasa reducen o previenen totalmente la reacción acrosomal de espermatozoides humanos capacitados (De Lamirande et al., 1998) ó de espermatozoides descongelados de muflones (Ovis musimon) (Berlinguer et al., 2003). La adición de alfa tocoferol al medio para congelar semen no tiene efecto en la capacitación de espermatozoides bovinos descongelados. No obstante, al adicionar alfa tocoferol y/o vitamina C al medio capacitante si se observa el bloqueo la capacitación y disminución de la peroxidación lipídica (O'Flaherty et al., 1997). 49 2.7.4. Criopreservación de semen con antioxidantes El proceso de criopreservación de semen está relacionado con un aumento de ROS (Wang et al., 1997; Saleh y Agarwal, 2002, Santiani, 2003) y disminución de la actividad de enzimas antioxidantes presentes en el plasma seminal (Álvarez y Storey, 1992; Lasso et al., 1994; Bilodeau et al., 2001). En ese sentido, se han realizado algunos estudios en ovinos (Watson y Anderson, 1983; Askari et al., 1994; Ollero et al., 1997; Sánchez-Partida et al., 1997, Santiani, 2003) y bovinos (Foote et al., 2002) para determinar si la adición de antioxidantes al semen previo al proceso de congelamiento reduce el daño peroxidativo causado por ROS. En ovinos, la adición de 2-4 mM de hidroxitolueno butilado (Watson y Anderson, 1983), alfa tocoferol (Askari et al., 1994; Ollero et al., 1997), lactoalbúmina, seroalbúmina (Ollero et al., 1997) y 25–50 mM de taurina (Sánchez-Partida et al., 1997) mejoran significativamente la motilidad, vitalidad e integridad de membrana luego del proceso de congelamiento-descongelamiento. No obstante, Sánchez-Partida et al. (1997) refieren que la adición de taurina no produce ningún efecto en la fertilidad. Otros antioxidantes como ácido ascórbico (Askari et al., 1994), hipotaurina ó carnosina (Sánchez-Partida et al., 1997) no mejoran la función espermática luego del proceso de congelamiento-descongelamiento. Por el contrario, la adición de carnosina y ácido ascórbico en concentraciones mayores a 50 mM reducen significativamente la motilidad (Sánchez-Partida et al., 1997). Criopreservación y Refrigeración de semen con Tempo y Tempol Los radicales nitróxidos, Tempo y Tempol, tienen actividad similar a la superóxido dismutasa (SOD) (Mitchell et al., 1990) y en comparación con la SOD, el Tempo y Tempol son de bajo peso molecular, altamente solubles y penetran la membrana celular fácilmente (Luo, 2001). En consecuencia, la adición de estos antioxidantes al medio de dilución debería mejorar la calidad de semen luego del proceso de congelamiento- descongelamiento. Sin embargo, el efecto del Tempo y Tempol en la calidad seminal no está bien estudiado. Uno de los primeros trabajos sobre criopreservación de semen con 50 estos antioxidantes fue realizado en bovinos, en donde se utilizaron Tempo y Tempol en concentraciones entre 0.2 y 10 mM en dilutores en base a leche descremada y en base Tris. En bovinos, la adición de 0,2 – 2 mM de Tempo y 0,2- 6 mM de Tempol al medio Tris-yema de huevo previo al congelamiento no produce ningún efecto en la motilidad espermática luego del proceso de congelamiento-descongelamiento (Foote et al., 2002). Por el contrario, cuando se utiliza leche descremada como diluyente en lugar de Tris-yema de huevo, la motilidad disminuye significativamente con concentraciones mayores a 0,2 mM de Tempo y Tempol (Foote et al., 2002). Similares resultados son reportados por Coutinho da Silva et al. (2008), quienes han utilizado entre 0.7 a 6 mM de Tempol para congelar semen de equino o espermatozoides obtenidos del epidídimo (Johnson y Coutinho da Silva, 2008) en un dilutor en base a leche descremada. Dichos resultados negativos o neutros del Tempo y Tempol pueden ser explicados porque de acuerdo a lo descrito por Santiani (2003), los niveles de ROS durante el proceso de criopreservación se incrementan recién al final de la curva de enfriamiento y por lo tanto su adición junto al dilutor estaría causando un efecto tóxico sobre los espermatozoides. En ese sentido, Santiani (2003) refiere que la adición de Tempo y Tempol 1 mM a los 35°C a un dilutor en base a leche descremada, causa una disminución significativa de la motilidad, en forma similar a lo descrito por Foote et al. (2002). Sin embargo, cuando se adicionan estos antioxidantes a los 5°C, es decir al final de la curva de enfriamiento, se consigue una motilidad superior al grupo control (Santiani, 2003). Similares resultados son reportados por Ruiz et al. (2007) quienes congelaron semen de ovino en un dilutor en base a Tris junto con Tempo 0.5 mM, el cual fue adicionado al final de la curva de enfriamiento. Asimismo, es posible incrementar la tasa de no retorno en celo (un indicador temprano de gestación) cuando se inseminan ovejas con semen congelado con Tempo 0.5 mM adicionado al final de la curva de enfriamiento (Santiani et al., 2007). Por otro lado existen otros estudios indicando un efecto positivo en la motilidad y viabilidad espermática durante el proceso de refrigeración (5°C) en espermatozoides de ovino (Mara et al., 2002, 2005), bovino (Lindemann y Kanous, 1991, citado por Foote et al., 2002), caprino (Mara et al., 2007) y pavo (Donoghue y Donoghue, 1997). También se han descrito un incremento en la tasa de clivaje en fecundación in vitro utilizando Tempol 2 51 mM (Mara et al., 2005) y porcentajes elevados de fertilidad al inseminar cabras con semen refrigerado con Tempol 1 mM (Mara et al., 2007). Es interesante destacar que para la refrigeración, el semen una vez mezclado con el dilutor, pasa directamente a 5°C, no requiriendo una curva de enfriamiento lenta que podría alterar la función espermática por acción de Tempo ó Tempol. En base a los anteriormente expuesto, es posible que en la mayoría de especies, los ROS produzcan efectos indeseables sobre la función espermática y que este efecto nocivo se vea exacerbado durante los procesos de criopreservación. Es por ello que sería interesante adicionar Tempo y Tempol al diluyente previo al congelamiento de espermatozoides de alpaca y estudiar su efecto en la producción de ROS y la funcionalidad espermática. 52 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Lugar de estudio El presente estudio consta de 3 experimentos que se desarrollaron conjuntamente en la Estación Experiemental IVITA-Maranganí (Sicuani, Cusco, Perú); en el Laboratorio de Reproducción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima, Perú); y en el Centro de Biotecnología de la Reproducción (CEBIOR), Facultad de Medicina Humana, Universidad de La Frontera (Temuco, Chile). Las actividades realizadas en cada una de las instituciones se presentan en el cuadro 5 Cuadro 5. Experimentos y actividades experimentales realizados de acuerdo a la institución de procedencia de las muestras Procesamiento y Procedencia de las Experimentos análisis de las Actividades Realizadas muestras muestras Vitrificación de Camal FMV-UNMSM espermatozoides Huancavelica Experimento 1 Vitrificación de IVITA-Maranganí FMV-UNMSM espermatozoides 53 Evaluación de semen Camal FMV-UNMSM Determinación del efecto Experimento 2 Huancavelica de ROS en espermatozoides. IVITA-Maranganí Criopreservación de semen FMV-UNMSM Evaluación de semen Experimento 3 IVITA-Maranganí CEBIOR-UFRO Evaluación de ADN espermático mediante citometría de flujo 3.2 Animales y manejo de muestras biológicas En total se han utilizado 16 alpacas machos para colección de semen y 21 testículos/epidídimos de animales castrados ó procedentes de camal para la recuperación de espermatozoides obtenidos a partir de la cola del epidídimo. Los testículos/epidídimos de alpaca procedieron del Camal Municipal de Huancavelica (n=12 obtenidos el año 2009 y n=9 en el 2012). Estas muestras fueron utilizadas para los experimentos 1 (n=6) y 2 (n=6), durante los meses de enero y febrero del año 2009. En el 2012 se repitió el experimento 1 utilizando 9 muestras de testículos/epidídimos (n=9). En todos los casos, inmediatamente después del beneficio de las alpacas, se retiró la túnica vaginal visceral de los testículos/epidídimos. Estos fueron lavados con suero fisiológico y colocados en frascos de plástico individuales con suero fisiológico a 5°C. Los frascos de plástico fueron transportados en una caja de tecnopor provisto de varios paquetes de gel refrigerante para mantener la temperatura a 5°C y enviados inmediatamente a la ciudad de Lima, para su posterior evaluación. Los testículos provenientes del Camal Municipal de Huancavelica que fueron utilizados en los experimentos 1 y 2 tuvieron un longitud mínima de 3.5 cm. 54 Los 16 alpacas Huacaya pertenecientes al IVITA-Maranganí (localizado a 3550 m.s.n.m.) presentaron pesos aproximadamente de 50 Kg en promedio. Estos machos fueron utilizados para los experimentos 1 y 3. La colección de semen se realizó durante los meses de enero y febrero del 2010, es decir durante la temporada reproductiva en camélidos sudamericanos. Los machos fueron mantenidos en corrales individuales durante la noche y durante el día sueltos en potreros con pastos cultivados. Para la colección de semen, las muestras fueron obtenidas utilizando el método de vagina artificial con hembras receptivas. Las muestras obtenidas fueron transportadas inmediatamente al laboratorio para su evaluación. Se utilizó una jeringa de 1mL con una aguja de 21 x 1 para disminuir la viscosidad seminal mediante la aspiración continua a través de la jeringa. Solamente las muestras que presentaron un mínimo de 30% de motilidad y 25 x 106 espermatozoides/mL fueron utilizadas para los experimentos sobre vitrificación (Experimento 1), efecto de Ros (Experimento 2) y criopreservación (Experimento 3) de espermatozoides. Los parámetros seminales evaluados en las muestras fueron: color, volumen, motilidad, concentración espermática, integridad funcional de membrana y vitalidad e integridad acrosomal. Adicionalmente en el experimento 3 se evaluó la integridad del ADN espermático. 3.3 Fase Experimental 3.3.1. Experimento 1. Desarrollo de un protocolo de vitrificación de espermatozoides de alpaca La finalidad del experimento 1 fue evaluar la factibilidad de utilizar un protocolo de vitrificación para espermatozoides de alpaca. En una primera etapa de este experimento se utilizaron 6 muestras obtenidas de la cola del epidídimo (realizado el 2009); en la segunda etapa se utilizaron 5 muestras de semen obtenidas con vagina artificial (realizado el 2010) y en la tercera etapa se utilizaron 9 muestras obtenidas de la cola del epidídimo (realizado el 2012). Las muestras de espermatozoides de la primera y segunda etapa fueron diluidas en un medio Tris base (27.1 g Tris, 14 g ácido cítrico, 10 g fructosa, csp. 1 litro) con albúmina 55 sérica bovina al 1% y ajustados a una concentración de 10 millones de espermatozoides/mL. Para la tercera etapa, la vitrificación se realizó utilizando un medio HTF (5.93 g cloruro de sodio, 0.35 g cloruro de potasio, 0.30 g cloruro de calcio dihidratado, 0.05 g sulfato de magnesio heptahidratado, 0.05 g fosfato de potadio, 2.10 g bicarbonato de sodio, 0.005 g de rojo fenol, 0.50 g de glucosa, 0.036 g de piruvato de sodio, 3.99 ml de lactato de sodio, 5.206 g de Hepes, 0.06 g de penicilina y 0.05 g de sulfato de estreptomicina). Cada muestra obtenida en cada una de las 3 etapas fue dividida para formar los siguientes grupos: - Fructosa: Vitrificación en medio con sacarosa en concentraciones 0.25, 0.5 y 1 M. - Sacarosa: Vitrificación en medio con sacarosa en concentraciones 0.25, 0.5 y 1 M. - Trehalosa: Vitrificación en medio con sacarosa en concentraciones 0.25, 0.5 y 1 M. La desvitrificación se realizó colocando las muestras en 2 mL de Tris base con albúmina sérica bovina al 1%. Se evaluó la motilidad y vitalidad/integridad acrosomal. 3.3.2. Experimento 2. Determinación del efecto especies reactivas de oxígeno (ROS) en la función de espermatozoides de alpaca. El experimento 2 fue realizado con la finalidad de estudiar el efecto de las especies reactivas de oxígeno en la funcionalidad de espermatozoides de alpaca. En este experimento se utilizaron 6 muestras obtenidas de testículos/epidídimos provenientes del Camal de Huancavelica el año 2009. Cada una de las muestras fue dividida en 2 partes para ser sometidas a los siguientes tratamientos: - Grupo Control: Incubados en medio Tris base (27.1 g Tris, 14 g ácido cítrico, 10 g fructosa, csp. 1 litro) a 37°C por 3 horas. - Grupo ROS: Incubados en el mismo medio Tris base a 37°C por 3 horas junto con polimorfos nucleares activados con 100 mM de acetato de PMA (phorbol myristate 56 acetate) para inducir la formación de ROS (de acuerdo a lo descrito por Villegas et al., 2003). La evaluación del daño celular en la motilidad espermática fue evaluada mediante los porcentajes de motilidad, integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal. 3.3.3. Experimento 3. Evaluación del efecto de 2 análogos de superóxido dismutasa durante el proceso de criopreservación de espermatozoides de alpaca. El objetivo del presente expermiento fue demostrar el efecto nocivo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la criopreservación de espermatozoides de alpaca, y evaluar el efecto de la adición de antioxidantes durante dicho proceso. En este estudio se trabajaron con 30 muestras de semen de alpacas (ver Anexo 2 y Anexo 3), provenientes de 9 machos. Cada muestra seminal fue dividida en 3 partes para formar los siguientes grupos: - Grupo Control: Criopreservación sin antioxidantes - Grupo Tempo: Criopreservación con análogo de superóxido dismutasa Tempo (2,2,6,6 btetramethyl-1-piperidiniloxoxyl, Aldrich 214000) en una concentración final 1 mM, adicionado al final de la curva de enfriamiento (10°C). - Grupo Tempol 1mM: Criopreservación con análogo de superóxido dismutasa Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 btetramethyl-1-piperidiniloxoxyl, Sigma H-8258) en una concentración final 1 mM, adicionado al final de la curva de enfriamiento (10°C). Luego del descongelamiento se evaluó la motilidad, integridad funcional de membrana plasmática, vitalidad/integridad acrosomal e integridad del ADN espermático. En este experimento también estaba previsto evaluar el efecto de la adición de antioxidantes análogos de superóxido dismutasa durante el proceso de vitrificación, sin embargo se descarto dicha idea pues los resultados del experimento sobre vitrificación (Experimento 1) no lograron proporcionar suficientes espermatozoides viables mediante esta técnica. 57 3.4 Procedimiento metodológico 3.4.1. Recuperación de espermatozoides de la cola del epidídimo Los testículos provenientes de animales beneficiados fueron procesados en el Laboratorio de Reproducción Animal (FMV-UNMSM) para desarrollar los experimentos 1 y 2. Inicialmente, los testículos fueron lavados con PBS a 37oC, y luego de una cuidadosa disección con instrumental quirúrgico básico (pinzas planas y tijeras), se separaron los epidídimos de sus respectivos testículos. Cada uno de los epidídimos así obtenidos, se lavaron 4 veces con PBS a 37oC y seguidamente, se separó la cola epididimaria mediante un corte con tijera. Las colas del epidídimo se colocaron en placas petri estériles y se dividieron en pequeñas secciones las cuales se suspendieron en 1 mL de PBS a 37oC por epidídimo y se prensaron suavemente con pinzas, hasta lograr la expulsión de los espermatozoides de los conductos epididimarios. La obtención de los espermatozoides se realizó recuperando el total del volumen de medio utilizado (1 mL) de PBS en un tubo eppendorf, de 1.5 mL, de acuerdo a lo descrito por Morton et al. 2007. 3.4.2. Colección de semen La colección de semen realizó utilizando el método de vagina artificial con hembras receptivas descrito por Dávalos y Olazábal (2002). Este procedimiento fue utilizado para realizar los experimentos 1 y 3. El día de la colección seminal, los machos fueron enfrentados con un grupo de alpacas hembras hasta que cada macho lograba hacer que una hembra adopte la posición de cópula. Cuando el macho se disponía a penetrar a la hembra, un operario se acercaba cuidadosamente y desviaba el pene del macho hacia una vagina artificial de ovino, permaneciendo en esa posición hasta el momento el cual el macho se ponía de pie y se retiraba. Se utilizó una vagina artificial de ovino, con una funda lineal de jebe y un tubo Falcon de 15 mL. La vagina artificial contenía aire a presión y se adicionaba agua a 55-60°C, para llegar a una temperatura interna de 40-42°C. La vagina artificial 58 estaba cubierta por una toalla y una frazadilla eléctrica, con la finalidad de mantener la temperatura durante la cópula. 3.4.3 Preparación del dilutor para criopreservación Se utilizó un dilutor en base a leche descremada que constó de 2 fracciones (A y B), en donde la principal diferencia consistió en la adición del agente crioprotector (Etilenglicol) a la fracción B del dilutor. Este dilutor ha sido descrito para congelación de espermatozoides de alpaca por Santiani et al. (2005). Para la primera fracción (fracción A) se mezclaron 95 mL de leche descremada, 5 mL de yema de huevo y 4.85 g de fructosa, en una probeta de 100 mL. La fracción B del dilutor se preparó en base a la solución anterior adicionándole etilenglicol para obtener una concentración de 0.2 M. 3.4.4. Criopreservación de espermatozoides Cada una de las muestras seminales fue alicuotada en 3 partes de 250 µL y diluida en una proporción 1:1 con la fracción A del dilutor en base a leche descremada (250 µL), haciendo un total de 500 µL. Estas muestras diluidas fueron enfriadas lentamente desde los 35oC hasta los 5oC, en un tiempo aproximado de 90 minutos, descendiendo en promedio 1°C cada 3 minutos. Al llegar a 5°C, se adicionó igual cantidad de la fracción B (500 µL) a cada uno de los grupos. Se dejó estabilizar por 30 minutos e inmediatamente se envasaron en pajillas de plástico transparentes de 0.25 mL. Finalmente, las pajillas se congelaron exponiéndolas a vapores de nitrógeno líquido por 15 minutos. Luego del congelamiento, las pajillas fueron almacenadas en un tanque de nitrógeno líquido, cuya temperatura interna es de alrededor a -196 oC. El descongelamiento de las pajillas se realizó en un periodo aproximado de 1 año (Experimento 3). Para el descongelamiento, las pajillas fueron retiradas del tanque con nitrógeno líquido e inmediatamente colocadas en baño maría a 42 oC durante 45 segundos. En el cuadro 6 se puede observar la formar de diluir las muestras para criopreservación. 59 Cuadro 6. Diluciones realizadas para criopreservación de espermatozoides de alpaca. Dilutor Dilutor Muestra diluida Grupo Muestra (Fracción A) (Fracción B) para congelar Control 250 µL + 250 µL + 500 µL = 1 mL Tempo 250 µL + 250 µL + 500 µL = 1 mL Tempol 250 µL + 250 µL + 500 µL = 1 mL 3.4.6. Vitrificación de espermatozoides El proceso de vitrificación se realizó en el experimento 2 con muestras obtenidas de la cola del epidídimo (n=6) y muestras de semen (n=5). Cada muestra de espermatozoides fue ajustada a una concentración de 1 x 106 espermatozoides/mL y diluida en un medio Tris base con albúmina sérica bovina al 1%, utilizando distintos tipos y concentraciones de azúcares (Sacarosa, trehalosa y fructosa, cada uno en concentraciones 0.2, 0.5 y 1 M). Las muestras fueron mantenidas con su dilutor por 5 minutos a 37°C antes de iniciar el protocolo de vitrificación. La vitrificación se realizó colocando gotas de 30 µL directamente a una caja con nitrógeno líquido. Las gotas formaron esferas sólidas al congelarse y se hundieron en el nitrógeno líquido. Posteriormente, las gotas vitrificadas fueron recuperadas, colocadas en tubos eppendorf de 1.5 mL y almacenadas en nitrógeno líquido hasta su evaluación. La desvitrificación se realizó retirando las esferas del nitrógeno y colocándolas en un 1 mL de medio Tris base a 37°C por 10 minutos. 3.5 Evaluación de características seminales 3.5.1. Espermatograma convencional 60 Los parámetros evaluados dentro del espermatograma convencional fueron: volumen, color, motilidad y concentración espermática. Para poder realizar dichas evaluaciones, las muestras procedentes de la cola del epidídimo (Experimentos 1 y 2) fueron suspendidas en 1 mL de PBS. En el caso de las muestras obtenidas mediante colección de semen (Experimentos 1 y 3) se utilizó una jeringa de 1mL con una aguja de 21 x 1 para disminuir la viscosidad seminal mediante la aspiración continua a través de la jeringa. Los registros de volumen fueron realizados mediante observación directa de las muestras contenidas en tubos eppendorf de 1.5 mL (Experimentos 1 y 2) ó tubos falcon de 15 mL (Experimento 3). Para evaluar la motilidad espermática se colocó 25 µL de cada muestra en una lámina portaobjetos temperada (37oC) y se observó en microscopio a 400x. Se determinó el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva sobre el total de espermatozoides en cada campo, evaluando un total de 10 campos. Los resultados se expresaron como porcentaje de motilidad progresiva. La concentración espermática se evaluó utilizando una dilución 1:20, tomando 10 µL de la muestra y depositándola en un tubo eppendorf de 1.5 mL, previamente cargado con 190 µL de agua. Posteriormente, la muestra diluida fue colocada por duplicado en una cámara de Neubauer, se dejó sedimentar 5 minutos y procedió a contar los espermatozoides dentro de los campos definidos en la cámara (5 cuadrantes), mediante el uso de un microscopio a 400x. El número total de espermatozoides contados dentro de los 5 cuadrantes fue multiplicado por el factor correspondiente (1 x 106). Se cálculo el promedio de las lecturas en ambas cámaras, y la concentración final de espermatozoides fue expresada en millones/mL. 3.5.2. Evaluación de la integridad funcional de membrana La evaluación de la integridad funcional de membrana fue realizada utilizando la prueba de estrés hipoosmótico ó HOS (Hypo Osmotic Swelling Test) descrito por Jeyendran et al. (1984) para espermatozoides humanos, y utilizado por Banda et al. (2010) en espermatozoides de alpaca. Esta técnica consiste en incubar los espermatozoides en una solución hipoosmótica para que respondan a dicho estrés con el hinchamiento de la 61 membrana plasmática en la parte distal de la cola. La solución hipoosmótica fue preparada con 0.735 g de citrato de sodio y 1.351 g de fructosa diluidos en 100 mL de agua bidestilada, alcanzando una osmolaridad aproximada de 100 mOsm. . Figura 4. Diferentes grados de reacción en espermatozoides expuestos al test hipoosmotico. (A: Espermatozoide con membrana alterada/dañada. B, C, D, E, F, G y H: Espermatozoides con integridad funcional de membrana intacta). Adaptado de Jeyendran et al.,1984). El procedimiento consistió en incubar 25 µL de la muestra de espermatozoides en 500µL de la solución hipoosmótica durante 1 hora a 37oC. Posteriormente, se colocó y extendió una gota de la suspensión resultante en una lámina portaobjetos y se procedió a la observación mediante microscopía a 400X. Se evaluaron 200 espermatozoides por lámina, considerando espermatozoides con membrana funcional alterada (HOS-) aquellos espermatozoides que no presentaron cambios en la cola (Figura 4A); mientras que se consideraron espermatozoides con membrana funcional intacta (HOS +) a los que reaccionaron al estrés hipoosmótico mediante la hinchazón/torsión de la parte distal de la cola espermática (Figura 4, B, C, D, E, F y G). Los resultados se expresaron en porcentaje de espermatozoides con membrana funcional intacta (HOS+). 62 3.5.3. Evaluación de vitalidad e integridad acrosomal La evaluación de la vitalidad espermática y en simultáneo de la integridad acrosomal fue realizada utilizando la técnica de doble tinción (DT) descrita por Didion et al. (1989) y modificada por Santiani et al. (2005) para espermatozoides de alpaca. Esta técnica consiste en la utilización de dos colorantes: Azul tripán (Sigma, T-0887) como indicador de vitalidad; y Giemsa (Merck, 1.09294.1022) que se adhiere a la matriz acrosomal. Para tal efecto se incubaron 50 µL de semen con 50 µL de azul tripán al 2% por 10 minutos a 37oC. Luego se realizó 3 lavados por centrifugación con PBS (37oC), centrifugando a 700 x g (1800 rpm) durante 6 minutos. El pellet resultante se resuspendió en 50µL de PBS y se extendió en una lámina portaobjeto. Posteriormente, se cubrió con solución de giemsa al 20% por 40 minutos preparada inmediatamente antes de usar. Finalmente, la lámina se enjuagó y secó. Para la lectura se observaron 200 espermatozoides a 1000x. Se consideraron espermatozoides vivos con acrosoma intacto a los que presentaron coloración transparente en la parte posterior a la línea ecuatorial de la cabeza y coloración fucsia en la región acrosomal. Los otros patrones de espermatozoides encontrado fueron los siguientes: espermatozoides vivos sin acrosoma (región pos ecuatorial transparente y región acrosomal transparente); espermatozoides muertos con acrosoma (región pos ecuatorial azul oscuro y región acrosomal fucsia); y espermatozoides muertos sin acrosoma (región pos ecuatorial azul oscuro y región acrosomal transparente). Los resultados se expresaron en porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto. 3.5.4. Evaluación de integridad de ADN espermático La evaluación de la integridad del ADN espermático fue realizada por la técnica de TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase – mediated dUDP Nick-End Labeling) utilizando un kit comercial (In situ cell death detection Kit, Fluorescein Roche Mannheim, BW, Germany). El procedimiento se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones para los espermatozoides de alpaca. Para la fijación, el contenido de cada pajilla (250 µL) fue lavado por centrifugación (500 x g) por 5 minutos en 63 10 mL de medio Tris base (27.1 g Tris, 14 g ácido cítrico, 10 g fructosa, csp. 1 litro). Los pellets resultantes luego de la centrifugación fueron resuspendidos y fijados agregando 5 mL de 4 % formaldehido diluido en PBS (24 g NaCl, 0.6 g KCl, 0.78 g KH2PO4, 3.3 g Na2HPO4, csp. 1 litro, pH 7.2), por 40 minutos a temperatura ambiental. Posteriormente se realizaron dos lavados con PBS por centrifugación. Para la permeabilización, el pellet fue resuspendido en 100 µL de solución Triton X-100 (Sigma T-9284) al 0.5%, diluido en 0.1% de citrato de sodio, por 15 minutos a 5°C. La solución de permeabilización fue retirada mediante lavados por centrifugación. Para el control positivo se resuspendió un pellet de espermatozoide en 2 UI de DNAsa I, incubándose 10 minutos a 37°C. Los espermatozoides en estudio se resuspendieron en 50 µL de solución de trabajo TUNEL (Enzime solution + Label solution). Al control negativo no se le adicionó la solución enzimática, solo con 50µL de Label solution. Las muestras fueron incubadas durante 60 minutos a 37 °C, en cámara húmeda y oscura. Luego de la incubación, las muestras fueron resuspendidas 500 µL de PBS y centrifugadas a 500 x g por 6 minutos. Los pellets fueron resuspendidos en 400µL de PBS, adicionando 2 µL de ioduro de propidio (PI: solución stock 2.4mM). Las muestras fueron transportadas a 4°C en cámara oscura para su lectura por citometría de flujo. 3.5.5. Evaluación mediante citometría de flujo La fluorescencia fue detectada utilizado un citómetro BD FACS Canto II TM (abril 2010) SN: V96101286, (USA). Un mínimo de 10,000 espermatozoides fueron incluidos en cada análisis. Los datos fueron analizados en escala logarítmica y utilizando el software BD FACSDiva TM (version 6.0). Para definir específicamente los parámetros de la población de espermatozoides de alpaca, se realizó un análisis comparando 2 parámetros: el tamaño (forward-Scatter-Height FSC-H) y la complejidad celular (side-Scatter-height SSC-H). En la figura 5a se presenta la población de eventos que fue seleccionada (dentro de la línea negra continua) como espermatozoides de alpaca, de acuerdo a su tamaño (FSC) y complejidad (SSC). 64 Para evaluar la integridad del ADN espermático, el kit de TUNEL utilizó la sonda fluorescente FITC (Fluorescein isothiocyanate conjugated) en su solución de trabajo. Adicionalmente se utilizo la sonda fluorescente PI (Propidium iodide) para comprobar la permeabilización celular. Se esperaba que las células espermáticas permeabilizadas con el ADN dañado incorporen tanto la sonda FITC como PI. Para definir las poblaciones en función de su fluorescencia a PI (Propidium iodide) y FITC (Fluorescein isothiocyanate conjugated), se realizaron los siguientes controles: autofluorescencia (espermatozoides vivos incubados sin TUNEL/ sin PI), control TUNEL (espermatozoides vivos tratados con ADNasa I e incubados sólo con TUNEL) y control PI (espermatozoides muertos incubados sólo con PI). Las figuras 5b, 5c y 5d representan los controles de autofluorescencia, control TUNEL y control PI, respectivamente, que fueron utilizados para definir los cuadrantes (R1, R2, R3 y R4) de las poblaciones espermáticas. Se observa que el control de autofluorescencia (Figura 5b) no muestra excitación ante la exposición a los filtros para FITC y PE, quedando la mayoría de eventos localizados en el cuadrante R3. En la figura 5c, el control TUNEL presenta un distribución hacia el cuadrante R4 (inferior derecho), indicando una mayor excitación con el filtro FITC y ninguna con el filtro PE. Por el contrario, el control PI (Figura 5d) presenta una mayor distribución hacia el cuadrante R1, indicando una mayor excitación con el filtro PE y muy poca con el filtro FITC. Luego de pasar los controles por el citómetro de flujo, las muestras fueron observadas en microscopio óptica y de fluorescencia (Microscopio Confocal Olympus, Fluoview FV1000, USA) para corroborar la lectura de citometría de flujo (Figura 6). En las figuras 6a y 6b se observa un espermatozoide del control PI que sólo presenta la fluorescencia roja y que bajo citometría fue clasificado en el cuadrante R1. En las figuras 6c y 6d se observa un espermatozoide del control TUNEL que sólo presenta la fluorescencia verde y que bajo citometría fue clasificado en el cuadrante R4. En las figuras 6e y 6f se observa un espermatozoide incubado con TUNEL y PI que presenta tanto la fluorescencia verde (TUNEL) como la roja (PI) y que bajo citometría fue clasificado en el cuadrante R2. Luego de definir las poblaciones espermáticas y los cuadrantes del Dot Plot, se evaluaron las muestras de espermatozoides de alpaca criopreservadas con los distintos 65 tratamientos. Los resultados se presentan porcentajes y en gráficos Dot Plots de dos parámetros (PI vs. TUNEL, leídos a través de los filtros PE y FITC, respectivamente) y expresados en porcentajes de espermatozoides TUNEL+ (espermatozoides con ADN fragmentado) (Figura 7). Figura 5. Selección y controles de la población de espermatozoides de alpaca para tinción de TUNEL por citometría de flujo. (5a) Muestra los eventos seleccionados para ser 66 analizados como espermatozoides de alpaca. (5b) Control de autofluorescencia. (5c) Control TUNEL. (5d) Control PI. Figura 6. Espermatozoides de alpaca evaluados mediante microscopia óptica y de fluorescencia con 400X, luego del análisis de citometría de flujo. Espermatozoide de control PI bajo microscopio óptica (Fig.6a) y de fluorescencia (6b). Espermatozoide de 67 control TUNEL bajo microscopio óptica (Fig. 6c) y de fluorescencia (6d). Espermatozoide permeabilizado y con ADN nuclear intacto visto bajo microscopia óptica (Figura 6e) y de fluorescencia (Fig. 6f). 3.6 Análisis estadístico Las pruebas estadísticas fueron realizadas utilizando el programa estadístico Prism® versión 3.0. Los porcentajes de motilidad, porcentajes de espermatozoides con membrana funcional intacta (HOS+), porcentajes de espermatozoides vivos con acrosoma intacto y porcentajes de espermatozoides con ADN fragmentado fueron transformados (ángulo = arcoseno √x) para acercar los datos a la distribución normal. Las pruebas utilizadas para cada análisis se presentan en el cuadro 7. Cuadro 7. Relación de variables independientes, variables dependientes y pruebas estadísticas utilizadas en cada experimento del presente proyecto Variables independientes Variables dependientes Pruebas utilizadas Experimento 1: % Motilidad ANOVA de 2 vías de Tipo y concentración de % Esp. Vivos con acrosoma contrastes ortogonales azúcar para vitrificación Experimento 2: % Motilidad, T-student Inducción ROS % HOS+ T-student % Esp. Vivos con acrosoma T-student Experimento 3: % Motilidad ANOVA 1 vía- Tukey Efecto de antioxidantes % HOS+ ANOVA 1 vía- Tukey % Esp. Vivos con acrosoma ANOVA 1 vía- Tukey % ADN fragmentado ANOVA 1 vía- Tukey 68 TUNEL+ vs. % Motilidad Correlación TUNEL+ vs. % HOS+ Correlación TUNEL+ vs % Esp vivos con Correlación acrosoma IV. RESULTADOS 4.1. Experimento 1. Desarrollo de un protocolo de vitrificación de espermatozoides de alpaca. En este experimento se trabajaron muestras espermáticas obtenidas de la cola del epidídimo y muestras obtenidas mediante colección de semen. Se realizaron los experimentos de acuerdo a lo diseñado, sin embargo, en la primera y segunda etapa no se pudieron recuperar espermatozoides mótiles (Cuadro 8 y 9), razón por la cual no se realizaron pruebas funcionales adicionales. Cuadro 8. Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=6) en una solución Tris base. Tipo de azúcar Espermatozoides Concentraciones finales de azúcares utilizado para al inicio del vitrificación experimento 0.25 M 0.5 M 1.0 M 69 Fructosa 0.00 0.00 0.00 Sacarosa 31.50 0.00 0.00 0.00 Trehalosa 0.00 0.00 0.00 Cuadro 9. Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de semen de alpaca (n=5) en una solución Tris base. Tipo de azúcar Espermatozoides Concentraciones finales de azúcares utilizado para al inicio del vitrificación experimento 0.25 M 0.5 M 1.0 M Fructosa 0.00 0.00 0.00 Sacarosa 57.00 0.00 0.00 0.00 Trehalosa 0.00 0.00 0.00 En la tercera etapa del Experimento 1, se utilizó un medio HTF para realizar la vitrificación espermática, en lugar del medio Tris base de las etapas anteriores. En este ensayo se lograron observar algunos espermatozoides viables luego del proceso de vitrificación, pero los porcetajes de motilidad evaluados fueron solamente alrededor del 1%. (Cuadro 10). El tipo de azúcar utilizado (sacarosa, fructosa, trehalosa) no tuvo efecto en la motilidad luego del proceso de vitrificación. Sin embargo, la concentración de azúcar si tuvo un efecto significativo (p< 0.05), en donde la concentración de 0.25 M proporcionó mejores porcentajes de motilidad en comparación con la concentración 1 M. No se observa una interacción entre el tipo y concentración de azúcar. En el cuadro 11, es posible observar los porcentajes de viabilidad/integridad acrosomal en las muestras vitrificadas en medio HTF. No se observan diferencias entre 70 tipos ni concentraciones de los azúcares utilizados. Sin embargo es interesante destacar que los promedios en general de cada grupo van alrededor de 4% de espermatozoides vivos, en comparación con la motilidad que es de aproximadamente 0.5% en cada grupo. Cuadro 10. Porcentaje de motilidad obtenida luego de vitrificar muestras de espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=9) en una solución HTF. Tipo de azúcar Espermatozoides Concentraciones finales de azúcares utilizado para al inicio del vitrificación experimento 0.25 M 0.5 M 1.0 M Fructosa 0.56 a (0.73) 0.33 a (0.50) 0.11 a (0.33) Sacarosa 1.22 a (2.17) 0.33 a (0.71) 0.22 a (0.44) 37.22 (14.39) Trehalosa 1.00 a (1.66) 0.33 a (0.71) 0.00 a (0.00) Total 0.93 a (1.57) 0.33 ab (0.61) 0.11 b (0.31) Valores son x ̅ (D.S.). a, b indican diferencias significativas en filas (p < 0.05). Cuadro 11. Porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto obtenidos luego de vitrificar muestras de espermatozoides de alpaca recuperados del epidídmo (n=9) en una solución HTF. Tipo de azúcar Espermatozoides Concentraciones finales de azúcares utilizado para al inicio del vitrificación experimento 0.25 M 0.5 M 1.0 M Fructosa 42.83 (8.94) 4.70 a (2.56) 3.42 a (3.90) 4.33 a (3.06) Sacarosa 5.83 a (5.11) 3.00 a (3.61) 4.20 a (3.94) 71 Trehalosa 4.25 a (5.32) 3.25 a (2.63) 2.33 a (1.81) Total 4.86 a (3.85) 3.27 a (3.08) 3.49 a (2.62) Valores son x ̅ (D.S.). a, b indican diferencias significativas en filas (p < 0.05). 4.2. Experimento 2. Estudio del efecto de las especies reactivas de oxígeno en la funcionalidad de los espermatozoides de alpaca. Los resultados del experimento 2 pueden observarse en el cuadro 12. Se observa que luego de la incubación por 3 horas con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA, los porcentajes de motilidad son significativamente menores (p< 0.05) en el grupo ROS (x ̅: 13.68; D.S.:5.72) en comparación con el grupo control (x ̅: 22.51; D.S.:4.89). En el caso de la integridad funcional de membrana (HOS+) y la vitalidad/integridad acrosomal, se aprecia una ligera disminución de estos indicadores en el grupo ROS. Cuadro 12. Efecto de la incubación de espermatozoides de alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS Parámetros Espermatozoides al Luego de incubación por 3 horas con seminales inicio del PMN activados con acetato PMA evaluados experimento Control ROS a b Motilidad (%) 27.20 (2.95) 22.42 (4.48) 13.67 (5.74) HOS + (%) 31.60 (4.39) 29.56a (5.24) 27.60a (8.53) Vitalidad/integridad 43.20 (11.12) 38.17a (8.47) 35.09a (7.32) acrosomal (%) Valores son x ̅ (D.S.). HOS + indican espermatozoides con membrana funcional a, b indican diferencias significativas en filas (p < 0.05). Comparaciones en filas no incluyen muestras de espermatozoides frescos. 72 4.3. Experimento 3. Evaluación del efecto de 2 análogos de superóxido dismutasa durante el proceso de criopreservación de espermatozoides de alpaca. En el cuadro 13 se presentan los resultados del experimento 3. Al comparar la motilidad espermática entre los 3 grupos, se observa que el grupo control (x:̅ 11.21; D.S.: 8.14 %) es significativamente menor (p< 0.05) que el grupo Tempol (x:̅ 22.08; D.S.: 7.48 %). De la misma manera al evaluar la integridad del ADN espermática, se observa que el grupo control presenta un mayor (p< 0.05) porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado (x ̅: 38.76; D.S.: 16.15%) en comparación con el grupo Tempol (x ̅: 16.72; D.S.:8.38 %). Una similiar tendencia se puede observar al comparar los porcentajes de integridad funcional de membrana (HOS+) y la vitalidad/integridad acrosomal, en donde los porcentajes encontrados en el grupo Tempol, son ligeramente superiores al grupo control, aunque sin observarse diferencias significativas (Cuadro 13). Cuadro 13. Efecto de la adición de antioxidantes (Control, Tempo 1 mM y Tempol 1 mM) durante la curva de enfriamiento (10 °C) para la criopreservación de espermatozoides de alpaca sobre la motilidad espermática, integridad de membrana, viabilidad e integridad acrosomal y daño del ADN espermático. Parámetros Semen Fresco Semen luego del proceso de criopreservación seminales Tempo Tempol evaluados Inicio Control (1 mM) (1 mM) a ab b Motilidad (%) 53.17 (15.62) 11.21 (8.14) 19.75 (6.48) 22.08 (7.48) HOS + (%) 23.47 (9.74) 9.85a (4.62) 14.48a (6.15) 13.12a (6.48) Vitalidad/integr. 45.93 (18.13) 28.18a (11.09) 30.66a (8.03) 32.71a (11.22) acrosomal (%) 73 TUNEL + (%) ----------- 38.76a (16.15) 25.41ab (5.79) 16.72a (8.38) Valores son x ̅ (D.S.) a, b indican diferencias significativas en filas (p < 0.05). Comparaciones en filas no incluyen muestras de semen fresco. HOS+ indican espermatozoides con membrana funcional. TUNEL+ indican espermatozoides con ADN fragmentado. Además se ha evaluado la relación existente en el porcetaje de espermatozoides que presentaron fragmentación del ADN (TUNEL+) en comparación con las demás variables. En el cuadro 14 se puede observar que únicamente existe una correlación significativa entre fragmentación de ADN (TUNEL+) y porcentaje de motilidad. En este caso, se observa una correlación negativa (p< 0.05), en donde r = -0.58. Cuadro 14. Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) y variables motilidad, integridad de membrana (HOS+) y vitalidad/integridad acrosomal Variables Correlación (r) Significancia TUNEL+ VS. Motilidad -0.58 p = 0.02 TUNEL+ vs. HOS+ -0.14 p = 0.72 TUNEL+ vs. Vitalid/acrosoma 0.18 p = 0.55 En la figura 7 se muestran ejemplos de gráficos Dot Plot correspondientes a los grupos Control (Fig. 7a), Tempo (Fig. 7b) y Tempol (Fig. 7c). En la figura 1a se observa una mayor distribución de eventos entre los cuadrantes R1 y R2, lo cual representan 74 espermatozoides con ADN intacto y espermatozoides con ADN fragmentados. Por otro lado, en las figuras 7b y 7c, se observa una mayor concentración de eventos localizados en el cuadrante R1, lo cual representa espermatozoides permeabilizados con ADN intacto. Figura 7. Análisis de citometría de flujo para evaluación de la integridad de ADN (TUNEL/PI) en la población de espermatozoides de alpaca criopreservadas por 3 tratamientos: (a) Grupo Control, (b) Grupo Tempo, (c) Grupo Tempol. Cuadrantes, R1: espermatozoides permeabilizados con ADN intacto ((TUNEL-/PI+) y R2: espermatozoides permeabilizados con ADN fragmentado (TUNEL+/PI+). R3: no permeabilizados con ADN intacto (PI-/TUNEL-); R4: espermatozoides no permeabilizados con ADN fragmentado (PI - /TUNEL +). 75 V. DISCUSIÓN Los resultados del presente trabajo demuestran por primera vez el efecto nocivo de las especies reactivas de oxígeno en la motilidad de espermatozoides de alpaca y en la fragmentación del ADN espermático. Así también se demuestra que la adición de un antioxidante análogo de superóxido dismutasa (Tempol 1 mM) durante el proceso de criopreservación permite reducir parcialmente la pérdida de motilidad espermática y evita el incremento de la fragmentación del ADN espermático. En relación al proceso de vitrificación, no se lograron obtener muestras viables de espermatozoides de alpaca luego de realizar este proceso. En el primer experimento se realizaron diversos ensayos de vitrificación utilizando espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo (Primera etapa, n=6 y tercera etapa, n=9) y muestras de semen (Segunda etapa, n=5) de alpacas. En la primera y segunda etapa, en ninguna de las repeticiones fue posible encontrar al menos un espermatozoide viable, habiendo utilizado un medio Tris base con 1% de BSA (Albúmina sérica bovina) y habiendo utilizado distintos tipos y concentraciones de azúcares (Sacarosa, trehalosa y fructosa, cada una en concentraciones 0.25, 0.5 y 1 M). En la tercera etapa del experimento 76 1 se vitrificaron espermatozoides de alpaca en un medio HTF con 1% de BSA evaluando los mismos tipos y concentraciones de azúcares que en la etapa anterior; y fue posible encontrar algunos espermatozoides con motilidad (menos del 1%) y algunos espermatozoides vivos (menos del 5%). Sin bien podemos decir que para vitrificar espermatozoides de alpaca el medio HTF es mejor que el Tris base, los resultados aún son muy bajos para en comparación con la criopreservación de semen. Experiencias previas sobre vitrificación espermática han sido descritas principalmente en humanos (Isachenko et al., 2004a, 2004b; Hossain y Osuamkpe, 2007). Al utilizar este método se evitan factores que han sido descrito como nocivos para la sobrevivencia espermática como la formación de cristales de hielo, la exposición de espermatozoides a sustancias crioprotectoras y exposición por un periodo prolongado a especies reactivas de oxígeno. Estos primeros trabajo fueron perfeccionados posteriormente estudiando el efecto de los medios de vitrificación (HTF, human tubarian fluid), la presencia de albúmina sérica humana (HSA) o la adición de agentes crioprotectores no permeantes como sacarosa 0.25 M (Isachenko et al., 2008). En espermatozoides caninos se ha logrado obtener resultados aceptables luego de experimentar con diferentes medios, porcentajes de albúmina y concentraciones de azúcares como sacarosa (Sánchez et al., 2011). Para esa caninos se ha definido como un medio adecuado de vitrificación el medio HTF (Human tubarian fluid) con 1% de BSA (Bovine seric albumin) y sacarosa 0.25 M. Similares experiencias fueron necesarias para encontrar un medio de vitrificación adecuado para espermatozoides de salmón (Oncorrhynchus mykiss), en donde se ha trabajado con un medio específico para mantenimiento de espermatozoides de pez (medio Cortland®) en lugar del medio HTF; además se ha concluido que la adición de 1% de BSA y 40% de plasma seminal confiere los mejores resultado en dicha especie (Merino et al., 2011). Aparentemente los espermatozoides de alpaca no podrían resistir el proceso de vitrificación. En un inicio se decidió utilizar el medio Tris base debido a que se recomendaba emplear un medio apropiado para mantener los espermatozoides de una determinada especie, y en este caso existía la experiencia previa que el medio era apropiado para espermatozoides de alpaca (Banda et al., 2010). Sin embargo debido a los resultados es que se cambia el medio de vitrificación por el HTF. El medio HTF ha sido utilizado para vitrificar espermatozoides de humanos (Isachenko et al., 2004a, 2004b) y de caninos 77 (Sánchez et al., 2011) y contiene compuestos como NaCl, KCl, CaCl2*2H20, MgSO4*7H2O, entre otros (Quinn et al., 1985) a diferencia del Tris base que carece de estas sales. Empleando este medio se obtuvieron algunas células viables luego del proceso de vitrificación, pero insuficientes en proporción para realizar cualquier otro estudio. Las razones por las cuales los espermatozoides de alpaca no toleran el proceso de vitrificación pueden ser varias y probablemente estén relacionadas a la combinación de 2 factores. El primero es que alguno de los componentes ó la combinación de determinados componentes del medio que utilizamos no hayan sido adecuados para conseguir la vitrificación esperada. Es conocido que el rol fundamental de las sustancias utilizadas en los medios es modificar la permeabilidad al agua de la membrana espermática y que existe una variabilidad entre especies que afectar los resultados en forma positiva o negativa (Holt, 2000). Esto podría explicar las diferencias obtenidas al comparar los medios Tris base y HTF. De todos modos, en nuestro estudio intentamos cubrir los principales efectos que afectarían la sobrevivencia espermática durante la vitrificación, como el uso de BSA al 1%, una concentración espermática de 1 x 106 espermatozoides/mL, y tres tipos de agentes crioprotectores no permeantes (sacarosa, glucosa y trehalosa en concentraciones de 0.25, 0.5 y 1M) en forma similar a lo reportado como exitoso para vitrificar espermatozoides de humanos. En este sentido, en nuestro estudio encontramos un efecto significativo de la concentración del crioprotector no permeante, en forma similar a lo reportado para caninos (Sánchez et al., 2011). El segundo factor podría estar relacionado a la naturaleza intrínseca del espermatozoide de alpaca. Se conoce que la exposición de una célula a temperaturas muy bajas induce cambios en la organización bidimensional de la membrana lipídica y puede modificar las propiedades cinéticas de las enzimas intramembranosas (Hammerstedt et al., 1990). Estos daños son más severos en especies en las cuales las concentraciones de colesterol son bajas y las concentraciones de ácidos grasos poli-insaturados son altas. De acuerdo a esto, algunas especies como los humanos son considerados más resistentes al daño durante el enfriamiento severo en comparación con otras especies como bovino y ovino. En ese sentido, los espermatozoides humanos son los únicos que se han podido vitrificar con éxito, mientras que están en desarrollo protocolos para vitrificar espermatozoides de salmón y de canino, no existiendo más reportes en otros mamíferos 78 domésticos. Si bien no existen estudios sobre la composición química de la membrana del espermatozoide de alpaca, los estudios realizados sobre criopreservación en esta especie indicarían que es una de las especies que tiene menos probabilidad de resistir el daño durante el proceso de enfriamiento (Santiani et al., 2005). En conclusión de acuerdo a nuestra metodología la vitrificación de espermatozoides de alpaca no permite obtener espermatozoides funcionales. En base a estos resultados no se realizó la vitrificación de espermatozoides de alpaca utilizando compuestos antioxidantes. En relación a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), para demostrar el efecto nocivo de ROS en la función de espermática, espermatozoides de alpaca fueron incubados por 3 horas a 37°C en un medio con polimorfos nucleares activados con PMA (phorbol myristate acetate). El PMA es conocido por ser un potente activador de neutrófilos y macrófagos resultante en la generación de grandes cantidades de ROS (Rehan et al., 1985). Villegas et al. (2003) describen que la producción de ROS es mínima cuando se incuban espermatozoides sólos o en presencia de polimorfos nucleares no activados, sin embargo, cuando se incubaron espermatozoides humanos con polimorfos nucleares y PMA, los niveles de ROS detectados mediantes quimioluminiscencia aumentan exponencialmente (casi en 40 veces sus valores basales). Dichos resultados concluyeron que los polimorfos nucleares producen ROS sólo en presencia de PMA. Basándonos en dicho estudio, realizamos un experimento similar, aunque no medimos directamente los niveles de ROS, en base a la evidencia anterior se asumió que se estaban produciendo grandes cantidades de ROS al realizar la incubación de espermatozoides de alpaca en presencia de polimorfos y PMA. Nuestros resultados indican que la motilidad luego de la incubación por 3 horas en un medio con PMN y PMA es significativamente menor (13%) en comparación con el grupo control que fue incubado en un medio Tris base (22%). Estos resultados nos permitirían inferir que se están produciendo ROS y que serían los responsables de afectar negativamente la motilidad en espermatozoides de alpaca, tal como ha sido reportado previamente en otros especies como humanos (Álvarez y Storey, 1989; Baumber et al., 2002) y ovinos (Santiani, 2003; Stefanov et al., 2004). En la evaluación de la integridad funcional de membrana y de la vitalidad/integridad acrosomal no se observó un efecto significativo de la incubación de espermatozoides de alpaca con PMN y PMA. Este mismo efecto ya ha sido descrito en anteriores oportunidades, como en el trabajo de Peris et al. 79 (2007) quienes refieren que la pérdida de motilidad es el indicador más sensible de estrés oxidativo en comparación con otros parámetros seminales en espermatozoides de ovinos (Peris et al., 2007). En resumen podemos afirmar que la motilidad de los espermatozoides de alpaca es particularmente sensible al efecto de los ROS producidos por polimorfos nucleares activados con PMA. Los resultados del experimento 2, demostraron que la disminución de la motilidad espermática en alpacas es inducida por especies reactivas de oxígeno (ROS). Asimismo existe evidencia que durante la criopreservación de semen, al disminuir la temperatura de enfriamiento a alrededor de 5°C se incrementa significativamente la producción de ROS (Wang et al., 1997; Santiani, 2003). En ese sentido, este estudio demostró que el efecto nocivo de la criopreservación en la motilidad espermática y la integridad del ADN espermático puede ser reducido parcialmente por la adición de un análogo de superóxido dismutasa denominado Tempol en concentración 1 mM. Es probable que el incremento en la producción de ROS asociado con la disminución de la temperatura descrito en espermatozoides de humanos sea el resultado de cambios en la integridad estructural y/o funcional de la membrana espermática (Wang et al., 1997). En ese sentido, el descenso en la temperatura cambia la distribución del patrón de grupos sulfidrilos (Chatterjee et al., 2001), migración de pequeñas regiones a través de la membrana plasmática y arreglos en localización de fosfolípidos (Medeiros et al, 2002) que podrían activar algunos de los mecanismos propuestos para la producción de ROS como el sistema NADPH oxidasa a nivel de la membrana plasmática. Conociendo que existe un incremento en la producción de ROS durante la curva de enfriamiento (Wang et al., 1997; Chatterjee y Gagnon, 2001) y que los ROS están relacionados con pérdida de motilidad y viabilidad espermática (Bell et al., 1993; Wang et al., 1997) es probable que los ROS sean responsables, al menos parcialmente, de la disminución de la calidad seminal por efecto de la criopreservación. La pérdida de motilidad espermática ha sido prevenida por la adición de Tempol a los diluyentes durante la refrigeración de espermatozoides de ovino (Mara et al., 2002) y de pavo (Donogue y Donogue, 1997). Del mismo modo la adición de Tempo entre 0.5 a 1 mM permite obtener mayores porcentajes de motilidad (entre 10 a 15%) en espermatozoides de ovinos (Santiani, 2003; Ruiz et al., 2007). En base a las evidencias obtenidas en otras 80 especies, la hipótesis planteada en nuestro estudio fue que la adición de Tempo y/o Tempol mejoraría la calidad espermática luego del descongelamiento de espermatozoides de alpaca. El Tempo y Tempol son nitróxidos con actividad similar a la enzima superóxido dismutasa (Mitchell et al., 1990) que reaccionan en presencia del anión superóxido (O .- 2 ), convirtiéndolo en peróxido de hidrógeno (Offer et al., 1998). Nuestros resultados nos permiten concluir que la adición de Tempol 1 mM al final de la curva de enfriamiento permite obtener un porcentaje significativamente mayor de motilidad luego del descongelamiento en espermatozoides de alpacas (22% versus 11% en el grupo control). Esto se podría explicar porque el Tempol reacciona con el anión superóxido formando peróxido de hidrógeno (Luo, 2001). Posteriormente, el peróxido de hidrógeno se convierte en un radical hidroxilo a través de la reacción de Fenton (Aitken y Fisher, 1994). Este radical es responsable directo del inicio de la peroxidación lipídica en espermatozoides de humanos y ratones (Aitken y Fisher, 1994). El Tempol aparentemente no tienen efecto sobre el peróxido de hidrógeno (Offer et al. 1998), pero al oxidar Fe y Cu evitan la reacción de Fenton (Luo, 2001). De esta manera, este nitróxido evitaría la formación de radicales hidroxilo a partir del peróxido de hidrógeno y por lo tanto bloquearían el inicio de la peroxidación lipídica. También es probable que el peróxido de hidrógeno sea removido por otros mecanismos como mediante la acción de la catalasa presente en la leche (Foote et al., 2002). Sin embargo, la formación de peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo no inician la peroxidación lipídica en espermatozoides de conejos (Álvarez y Storey, 1989). En este caso, la protonación del anión superóxido a radicales hidroperóxilo inicia la peroxidación lipídica (Aitken y Fisher, 1994). De este modo, la reacción del anión superóxido a peróxido de hidrógeno por efecto del Tempol reduciría la formación de radicales hidroperóxilo y por lo tanto estaría previniendo la peroxidación lipídica. Consecuentemente, la disminución en la producción de ROS y peroxidación lipídica como resultado de la adición de estos nitróxidos indicarían que la dismutación del anión superóxido a peróxido de hidrógeno y/o el bloqueo de la formación de radicales hidroxilo interfieren con el inicio de la peroxidación lipídica en espermatozoides de alpaca. Estos hechos se reflejarían en la mejor motilidad espermática obtenida en el grupo Tempol 1 mM luego del proceso de criopreservación en comparación con el grupo Control (diferencia de aproximadamente 11%). 81 El análisis del ADN espermático en nuestro experimento también indicó un efecto positivo de la adición de Tempol 1 mM en la integridad del ADN espermático en alpacas. La evaluación de la integridad del ADN espermático en diferentes especies de mamíferos, incluido el hombre, es necesaria para la utilización de espermatozoides en técnicas de reproducción asistida, debido a que un incremento en el daño del ADN se ha asociado a falla reproductiva. El presente estudio confirma el efecto favorable de la utilización de antioxidantes como componentes de los medios diluyentes para prevenir el daño al ADN espermático durante la criopreservación de semen de alpaca. En el grupo tratado con Tempol, el porcentaje de fragmentación del ADN espermático fue en promedio 16%, mientras que en un reporte previo (Rodríguez, 2009), se señala que la fragmentación del ADN en espermatozoides frescos de alpaca es de alrededor del 13%. En nuestro estudio, en el grupo de espermatozoides de alpaca criopreservados sin antioxidantes, la fragmentación del ADN espermático llega hasta 38%. Esto indica que la utilización del antioxidante Tempol como parte del diluente para criopreservación de semen de alpaca, evitaría en forma significativa el daño al ADN espermático, alcanzando porcentajes muy similares a los encontrados en muestras de semen fresco, esto implica que el no utilizar antioxidantes durante la criopreservación el daño al ADN espermático aumenta en casi un 25%. Estos resultados se explicarían porque durante la criopreservación de espermatozoides la producción de ROS se incrementa significativamente (Wang et al., 1997; Santiani, 2003). Estos posibles niveles elevados de ROS estarían relacionados con la fragmentación del ADN en espermatozoides de alpaca. Este estudio también describe por primera vez la determinación de la fragmentación del ADN en espermatozoides de alpaca mediante el ensayo de TUNEL evaluado por citometría de flujo. El método de TUNEL se basa en que durante la fragmentación del ADN espermático, se producen fragmentos de ADN o cadenas simples de ADN, las cuales son factibles de ser detectados mediante la incorporación de nucleótidos marcados con fluoresceína (Gorzcyca et al., 1993). Los espermatozoides marcados con la sonda del TUNEL presentan una fluorescencia de color verde, que podría ser evaluada mediante microscopia de fluorescencia o mediante citometría de flujo. En el caso de las lecturas mediante microscopia de fluorescencia, se recomienda contar 200 espermatozoides por duplicado para disminuir la probabilidad de error (WHO, 2002), lo cual puede 82 constituir la evaluación en un proceso largo y tedioso. Por el contrario, la evaluación del ensayo de TUNEL mediante citometría de flujo se realiza en segundos y evaluando un población de 10 000 espermatozoides, constituyendo entonces un análisis más objetivo y replicable (Muratori et al., 2008). El porcentaje de daño espermático encontrado mediante citometría de flujo puede ser el doble o hasta el triple que los detectados mediante microscopia del fluorescencia (Muratori et al., 2008). Esto podría explicar los menores porcentajes de ADN fragmentado (15-20%) encontrados en espermatozoides de alpaca (Rodríguez, 2009), donde utilizaron TUNEL y microscopia de fluorescencia, en contraste con nuestro estudio, donde se realizó TUNEL y citometría de flujo con valores que fluctuaron entre 15 a 40%. De acuerdo a nuestros resultados, la adición de Tempol 1mM al diluente en base a leche descremada reduce la fragmentación del ADN en espermatozoides de alpaca durante el proceso de criopreservación, obteniendo un mayor número de espermatozoides con ADN intacto para ser utilizados en técnicas de reproducción asistida. En el presente experimento no se observaron mejores porcentajes de integridad funcional de membrana ni de viabilidad e integridad acrosomal cuando se utilizaron los antioxidantes análogos de superóxido dismutasa. Esto podría explicarse porque la peroxidación lipídica altera los mecanismos de control a nivel de membranas que permiten llevar a cabo la reacción acrosomal (Peris et al., 2007). Se sabe que las especies reactivas de oxígeno (ROS) tienen la capacidad de iniciar la cascada de la peroxidación lipídica en la membrana espermática y que la peroxidación de los lípidos de la membrana se correlaciona con disminución de la motilidad espermática (Storey, 1997). Asimismo, de acuerdo a lo reportado por Morton et al., (2010) y Santiani et al. (2005) en espermatozoides de alpacas y Gil et al. (2003) en espermatozoides de ovinos, la cantidad de daño acrosomal producido por el proceso de criopreservación es menor al 5 y 10%, respectivamente. Por lo tanto es probable que al existir un reducido daño a nivel acrosomal durante la criopreservación, y al existir diversos grados de peroxidación lipídica en la membrana espermática, las variables relacionadas a la regulación adecuada de membranas no hayan sido favorecidas por la adición de los análogos de superóxido dismutasa. En relación a nuestro método de criopreservación, podemos observar que los porcentajes de motilidad (11%) obtenidos luego del proceso de criopreservación en el grupo control son ligeramente menores a los descritos anteriormente para criopreservación 83 de semen de alpaca (Santiani et al., 2005), sin embargo los otros parámetros evaluados (Integridad de membrana y vitalidad/integridad acrosomal) son similares a los descritos para espermatozoides epididimarios de alpaca (Banda et al., 2010). Es posible que estos pobres resultados en la motilidad espermática en el presente estudio se deben a la motilidad inicial de la muestras que fue aproximadamente 50%, mientras que Santiani et al. (2005) iniciaron su experimento con motilidades de alrededor del 70%. De todos modos consideramos que el protocolo de criopreservación utilizado en este estudio fue válido para estudiar posteriormente el efecto de la adición de los antioxidantes análogos de superóxido dismutasa. Una característica peculiar del dilutor en base a leche descremada que trabajamos es que utiliza etilenglicol 0.1 M como agente crioprotector, en comparación con otros dilutores donde se utiliza glicerol 1 M (Gonzáles et al., 2008). El efecto comparativo entre glicerol y etilenglicol no ha sido estudiado en otros trabajos para espermatozoides de alpacas. Es probable que el etilenglicol a una concentración 0.1 M brinde una mejor protección en comparación con el glicerol para el congelamiento de espermatozoides de alpaca, tal como ha sido demostrado en otras especies (Gilmore et al., 2002) y en muestras de semen de alpacas (Santiani et al. (2005) y muestras obtenidas de la cola del epidídimo (Banda et al., 2010). En consecuencia, la utilización de etilenglicol, como agente crioprotector para el congelamiento de espermatozoides de alpaca podría constituir una alternativa factible de ser utilizada. Debemos considerar que la mayoría de trabajos antiguos sobre criopreservación espermática en camélidos sudamericanos utilizaron muestras de semen completo (McEvoy et al., 1992; von Baer et al., 1999; Valdivia et al., 2000; Aller et al., 2003; Santiani et al., 2005), mientras que actualmente se viene trabajando con espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo (Morton et al., 2007, 2009). En nuestro trabajo, en los experimentos 1 y 2, se utilizaron espermatozoides procedentes de la cola del epidídimo y por lo tanto no estuvieron expuestos al plasma seminal. En ese sentido, Rodríguez (2009) indican que no existe un efecto protector por parte del plasma seminal, al menos durante la criopreservación de espermatozoides de alpaca cuando se congela espermatozoides epididimarios con plasma seminal en proporción 1:1, mientras que recientemente, Kershaw-Young y Maxwell (2011) reportan que la incubación de espermatozoides 84 epididimarios y eyaculados con 100% del plasma seminal afecta negativamente la calidad espermática en alpacas, pero con 10% de plasma seminal se pueden obtener mejores resultados. Es probable que ciertas proteínas presentes en el plasma seminal puedan proteger la membrana plasmática de los espermatozoides del estrés por frío en el proceso de criopreservación (Colás et al., 2009; Leahy et al., 2009). Por otro lado en espermatozoides epididimarios de equinos (Heise et al., 2011) si bien la adición de plasma seminal puede mejorar inicialmente la motilidad progresiva, no tiene efecto en la calidad seminal post- descongelamiento. En consecuencia, los trabajos de con espermatozoides epididimarios se constituyen en buenos modelos para el estudio de la criopreservación de semen de alpaca y mientras existan dificultades para colectar buenas muestras de semen de alpaca, es posible ir estudiando diversos protocolos de criopreservación utilizando espermatozoides de alpaca obtenidos de la cola del epidídimo. 85 VI. CONCLUSIONES 1. Los niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS) disminuyen significativamente la motilidad en espermatozoides de alpaca en un 50%. 2. Las variables espermáticas de función celular como integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal no son afectadas por niveles elevados de ROS. 3. La utilización de un antioxidante análogo de superóxido dismutasa (Tempol 1 mM) como parte del dilutor para la criopreservación de espermatozoides de alpaca previene parcialmente la pérdida de motilidad (50%) y la fragmentación del ADN espermático (50%). 86 4. Existe una correlación negativa moderada entre motilidad espermática y fragmentación del ADN espermático en espermatozoides de alpaca. 5. La pérdida de variables espermáticas de función celular como integridad funcional de membrana y vitalidad/integridad acrosomal durante el proceso de criopreservación no son prevenidas por la adición de antioxidantes análogos de superóxido dismutasa. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aisen E, Álvarez H, Venturino A, Garde J. 2000. Effect of trehalose and EDTA on cryoprotective action of ram semen diluents. Theriogenology 53:1053-1061. Aitken R. 1994. A free radical theory of male infertility. Reprod Fertil Dev 6:19-24. Aitken R. 1999. The amoroso lectures. 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Muestras de buena calidad Muestras de mala calidad Total Macho id Congeladas Vitrificadas Plasma Eliminadas 1 1 1 3 5 2 2 2 3 3 1 1 4 4 4 1 5 5 0 112 6 0 7 5 1 5 8 0 9 4 1 1 1 6 10 4 1 5 11 1 1 2 12 2 2 4 13 2 1 1 2 5 14 2 2 15 5 1 5 16 0 Total 30 5 6 14 50 * Las 5 muestras vitrificadas también fueron utilizadas para la criopreservación Anexo 3. Características seminales de las muestras utilizadas en los experimentos 1 y 3. N° Macho Vol (mL) Millones esp/mL Mot. (%) 1 9 2 33 32.5 2 10 0.6 16 20 3 7 0.5 50 45 4 4 0.3 9 65 5 15 75 30 6 13 0.9 170 65 7 9 2.3 29.5 67.5 8 10 0.7 113 40 9 7 1.5 143 55 10 12 1.1 40 22.5 11 15 1.1 118 50 12 9 3.5 113 65 13 4 1.4 40 55 14 10 0.5 25 40 113 15 3 1.1 187 40 16 4 1.4 26 62.5 17 7 1.4 212 50 18 1 0.5 33 50 19 12 2 134 45 20 15 0.9 101 50 21 9 3.5 80 80 22 10 3.2 15 65 23 3 1.2 125 47.5 24 4 0.9 25 80 25 7 1.2 320 40 26 15 1.3 70 70 27 3 1.6 99 50 28 7 2 52 60 29 13 2.2 14 45 30 15 1.1 58 62.5 31 1 1.7 17 25 Promedio 1.55 90.75 53.17 D.S. 0.84 70.92 15.62 Anexo 4. Efecto del tipo y concentración de azúcares en la motilidad de espermatozoides de alpaca luego del proceso de vitrificación. Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F Nivel de variación cuadrados libertad medio significancia Concentración 0.030 2 0.015 4.254 0.018 Tipo azúcar 0.001 2 0.000 0.101 0.904 Conc * Tipo 0.003 4 0.001 0.199 0.938 Error 0.254 72 0.004 Total 0.374 81 Anexo 5. Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la motiliad espermática. 114 Unpaired t test P value 0.0147 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=2.944 df=10 Anexo 6. Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la integridad funcional de membrana (HOS+). Unpaired t test P value 0.6504 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=0.4688 df=9 Anexo 7. Efecto de la inducción de la incubación de espermatozoides de alpaca con polimorfos nucleares activados con acetato de PMA para inducir la formación de ROS en la vitalidad/integridad acrosomal. Unpaired t test P value 0.5162 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=0.6731 df=10 Anexo 8. Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) en la motilidad de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F Nivel de 115 variación cuadrados libertad medio significancia Grupos 443.0 2 221.5 4.101 0.0341 Error 972.1 18 54.01 Total 1415 20 Anexo 9. Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) en la integridad funcional de membrana (HOS+) de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F Nivel de variación cuadrados libertad medio significancia Grupos 90.87 2 45.43 1.334 0.2839 Error 749.3 22 34.06 Total 840.1 24 Anexo 10. Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) en la vitalidad/integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F Nivel de variación cuadrados libertad medio significancia Grupos 92.75 2 46.37 0.4439 0.6467 Error 2507 24 104.5 Total 2600 26 Anexo 11. Efecto de la adición del antioxidante (Control, Tempo, Tempol) en la framentación del ADN (TUNEL +) de espermatozoides de alpaca luego del proceso de criopreservación. Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F Nivel de 116 variación cuadrados libertad medio significancia Grupos 1315 2 657.4 5.684 0.0145 Error 1735 15 115.7 Total 3050 17 Anexo 12. Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) y motilidad espermática. Number of XY Pairs 12 Pearson r -0.5873 95% confidence interval -0.8685 to -0.02004 P value (one-tailed) 0.0223 P value summary * Is the correlation significant? (alpha=0.05) Yes R squared 0.3449 Anexo 13. Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) e integridad funcional de membrana (HOS+). Number of XY Pairs 9 Pearson r -0.1392 95% confidence interval -0.7354 to 0.5785 P value (two-tailed) 0.7209 P value summary ns Is the correlation significant? (alpha=0.05) No R squared 0.01939 Anexo 14. Correlación en porcentaje de fragmentación de ADN (TUNEL+) y vitalidad/integridad acrosomal. Number of XY Pairs 13 117 Pearson r 0.1829 95% confidence interval -0.4095 to 0.6668 P value (two-tailed) 0.5498 P value summary ns Is the correlation significant? (alpha=0.05) No R squared 0.03345 118